Гепатит с пцр: качественный и количественный анализ крови, расшифровка результатов

Содержание

как подготовиться к сдаче анализа, диагностика и расшифровка показателей

Гепатит С переходит из острой фазы в хроническую в 80% случаев. Репликация болезнетворных вирусов в функциональных клетках печени ведет к дисфункции органа. Это обусловлено тем, что паренхиматозная ткань заменяется соединительной. В результате анамнез больного дополняется кровотечениями в ЖКТ, интоксикацией организма, проблемами со свертываемостью крови. Поэтому чем раньше будут диагностированы патологические изменения, тем больше у пациента шансов на выздоровление. Анализ ПЦР на гепатит С считается наиболее точным методом исследования.

Этот диагностический метод разрешено проводить спустя несколько дней после заражения. Полимеразная цепная реакция позволяет достоверно определить генотип и концентрацию вируса в крови. Чтобы сделать анализ, у пациента берут биологический материал, в котором может присутствовать РНК возбудителя.

ПЦР на гепатит С осуществляют в три этапа:

Качественный анализ – с его помощью определяют генетический материал возбудителя.
Количественное исследование – таким образом выявляют вирусную нагрузку.
Генотипирование – на этой стадии врач узнает разновидность заболевания.

Методику разработали около 30 лет назад. Ее применяют для диагностики многих инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет обнаружить уникальный генетический материал. Для этого используют праймеры. Так называют короткие нити РНК, которые присоединяют к началу гена.

Анализ ПЦР

В результате количество фрагментов болезнетворного вируса многократно увеличивается. Каждая фаза требует особого температурного режима и определенного промежутка времени. Молекула ДНК формируется в течение 3 минут. Амплификация включает в себя около 30 циклов. ПЦР делают в лаборатории посредством специального оборудования.

Показания к назначению

Сдача анализа ПЦР может быть обусловлена наличием клинических симптомов гепатита С. Процедура показана людям, которые:

контактировали с инфицированным человеком;
страдают от острых и хронических заболеваний печени;
проходят лечение от патологических изменений в паренхиматозной ткани;
входят в группу риска;
являются донорами крови и ее компонентов.

ПЦР осуществляют не только при гепатите С. Анализ используют в медицине, биологии, криминалистике. Определение специфических показателей – этап, необходимый для подбора лекарственной схемы.

Преимущества анализа

В схему диагностического обследования включают иммунофлуоресцентный анализ и ПЦР. С помощью первого можно определить концентрацию иммуноглобулинов. Эти вещества вырабатываются защитным механизмом после проникновения болезнетворных вирусов в организм. В отличие от ПЦР ИФА не обладает эффективностью во время инкубационного периода. С помощью полимеразной цепной реакции гепатит С можно выявить в первые 7 дней после инфицирования.
<noscript><img src='/800/600/https/03online.com/media/upload/comments/img_3696_1_1.jpg' /></noscript> youtube.com/embed/c6R2TLt6k14″ frameborder=»0″ allowfullscreen=»allowfullscreen»/>
Данное клиническое исследование обладает следующими характеристиками:

Минимальная вероятность ложного результата.
Высокая эффективность.
Специфичность.
Чувствительность.
Универсальность.
Автоматизация процесса.
Безопасность.
Скорость получения показателей.

Единственным минусом ПЦР является ее техническая сложность. Это связано с тем, что врачу необходимо подобрать правильный состав нуклеотидов, в функциях которых синтез ДНК. Из-за повышенной чувствительности метода возможно получение ложноположительного или ложноотрицательного результатов.

Чтобы добиться точности значимых показателей, биологический материал тщательно очищают от медикаментозных препаратов и белковых соединений. Для подтверждения результата требуется сравнение ранее проверенных образцов. К факторам, провоцирующим ошибку, причисляют:

Нарушение техники забора анализа

Нарушение техники забора анализа.
Изменения в последовательности фрагментов РНК.
Совпадение синтезируемых нуклеотидов и генов болезнетворных вирусов.

Вероятность получения ложного результата при гепатите С присутствует из-за невозможности определения генетической основы заболевания. ПЦР-диагностика позволяет напрямую выявить возбудителя. С помощью амплификации ДНК происходит обнаружение болезнетворных микроорганизмов в продуктах питания, воде и почве.

Ограничения, касающиеся данного метода, не уменьшают его эффективности и популярности. Клиническое исследование проводят регулярно. Таким образом врач может оценить эффективность принятых лечебных мер. Необходимость в этом возникает из-за того, что вирус гепатита С способен мутировать. Отсутствие положительного эффекта означает адаптацию вируса к применяемым лекарственным средствам.

Подготовка к сдаче

Для того чтобы провести полимеразную цепную реакцию у больного, страдающего от гепатита С, берут венозную кровь. Обычно для изучения требуется две порции биологического материала. Посредством одной делается непосредственно ПЦР, а другую направляют на иммуноферментный анализ.

Кровь для анализа ПЦР берут из вены

Подготовка имеет большое значение. Пациент сдает кровь на ПЦР утром на голодный желудок. За несколько дней до процедуры придется отказаться от вредных продуктов питания, спиртных напитков, никотина и наркотиков. Больному следует избегать половых контактов, чрезмерной физической и эмоциональной нагрузки. Бассейн и спортзал оказываются под запретом. Подготавливаться придется в любом случае.

Существуют особые указания относительно медикаментозных препаратов. Это касается антибиотиков и антидепрессантов. Женщины, у которых начались менструации, должны отсрочить сдачу анализа на гепатит С. Кольпоскопия также является поводом для отказа от процедуры.

Перечисленные правила довольно просты. Благодаря им, можно добиться максимальной достоверности данного диагностического метода. Расшифровывать результаты должен специалист. Самостоятельно интерпретировать их у пациента вряд ли получится.

Процесс сдачи анализа

ПЦР-диагностику осуществляют следующим образом:

Кровь помещают в термостат

Сначала забирают биологический материал. Кровь помещают в простерилизованные приспособления. Необходимый объем не превышает 1-1,5 мл. Держать кровь и ее компоненты следует не дольше 24 часов. Температура хранения не должна превышать 4 градусов по Цельсию.
После начинают клиническое исследование. Подготовленную кровь помещают в термостат вместе с амплификационной смесью. Обычно требуется не более 25 мл специального состава. Амплификация проводится в автоматическом режиме на протяжении нескольких часов.
Параллельно делают контрольные анализы. Для этого используют биологические материалы, взятые у здорового человека. Это поможет избежать ложных результатов.

Расшифровка и регистрация показателей. Генетический материал обнаруживают с помощью бромистого этидия. Благодаря специфическому воздействию, фрагменты ДНК высвечиваются. Наличие (отсутствие) вируса выявляют ориентируясь на данные таблицы.

7 МЕ/мл). Нормой (отрицательным результатом) считается отсутствие специфических антител и частиц вирусной РНК. На этапе генотипирования об инфекционном заражении свидетельствует РНК определенного генотипа.

При получении положительного результата больному назначают эффективную терапевтическую схему. При этом обязательно учитывают информацию о наличии вируса в крови, степени его активности и генотипе. Цена процедуры зависит от методики тестирования, вида биологического материала. К общей стоимости могут быть добавлены затраты за забор крови или других жидкостей. Последнее обусловлено тем, что возбудителя часто обнаруживают в урине, каловых массах и сперме.

Качественный анализ ПЦР на гепатит С — что это? 💉

Вирусный гепатит С является одним из самых серьезных заболеваний, с которым может столкнуться современный человек. Проблема в том, что это тяжелое заболевание протекает практически бессимптомно, и человек может чувствовать себя нормально, в то время как коварный недуг наносит непоправимый урон его печени.

Чтобы избежать опасных последствий, необходимо своевременно диагностировать ВГС. Одним из лучших диагностических методов является анализ ПЦР качественный на гепатит С. Этот способ выявления диагноза является наиболее информативным и совершенно безболезненным для пациентов. Но как сдавать анализ на гепатит С ПЦР? Что представляет собой данный анализ? Как диагностируется гепатит с методом ПЦР? Поговорим об этом в статье.

Анализ на гепатит С качественный — что это?

В настоящее время существует немало методов диагностики вирусных заболеваний, включая ВГС. Но анализ крови ПЦР по гепатиту С — что это такое? Прежде всего следует сказать, что это – исследование биологических материалов пациента на предмет обнаружение патогена ВГС. Анализ крови ПЦР на гепатит С проводится в лабораторных условиях. Это исследование требуется абсолютно всем пациентам, в чьей крови были обнаружены антитела к антигенам гепатовируса. Основной целью ПЦР-диагностики гепатитов является выявление флававируса.

Аббревиатура ПЦР расшифровывается как «Полимеразная цепная реакция». Это означает, что при помощи данного анализа гепатита С качественного выявляется максимальная площадь поражения гепатовирусом клеток и тканей печени. Этот аналитический метод позволяет определить количественные масштабы поражения организма, а также качественные характеристики патогена.

Благодаря результатам качественного анализа на гепатит ПЦР, лечащие гепатологи могут определиться со схемой терапии ВГС для конкретного пациента. Также благодаря этому методу определяется длительность терапевтического курса, так как с его помощью можно определить то, насколько сильное заражение необходимо побороть.

Исследование проведено при поддержке научно-исследовательского института индийского фармацевтического производителя Zydus Heptiza. Официальный сайт в России Zydus.ru

Как сдавать анализ на гепатит С ПЦР?

При постановке диагноза ВГС проводится большое количество различных исследований с целью выявления максимально подходящего способа терапии рассматриваемого заболевания. Но как сдавать анализ на ПЦР при гепатите С?

Прежде чем ответить на этот вопрос, следует уточнить, что рассматриваемый тип анализов еще называют РНК-тестом. Ведь во флававирусе располагается частица РНК, габариты вириона которой – от 30 до 60 нм. Вирус склонен к мутациям, и это всегда учитывается при диагностике подобного типа. Резистентность каждого генотипа патогена ВГС значительно различается, поэтому прогноз течения болезни очень сильно зависит от этого анализа на качественный гепатит.

Но как сдавать кровь на ПЦР на гепатит С? При диагностике большое значение имеют как подготовительные действия пациента, так и сама процедура сдачи крови:

В течение суток до сдачи крови на качественный ПЦР на гепатит пациенту следует отказаться от жирной пищи, алкоголя и табакокурения. В противном случае результаты окажутся неточными;
Вечером, накануне сдачи анализа крови на гепатит с ПЦР, больной не должен ничего есть;
Сдавать биологические материалы следует ранним утром, до 8 часов. Есть и даже пить перед этим категорически запрещается;
Образец крови пациента собирают из вены при помощи одноразового стерильного шприца. В рамках личной безопасности пациенту рекомендуется проследить, чтобы процедура проводилась исключительно стерильным шприцом.

После прохождения анализа на гепатит С ПЦР пациент отправляется домой. Крови для лабораторного тестирования забирается немного, поэтому негативных эффектов от незначительной ее потери не последует.

Расшифровка результатов исследования

Расшифровкой ПЦР диагностика гепатита С занимаются в лабораторных условиях. Работники лабораторий проводят ряд специфических исследований, результат которых фиксируется в письменном виде. Стандартизированная чувствительность теста, благодаря которой можно выяснить наличие и распространение патогена, колеблется в пределах от 10 до 500 МЕ/мл.

Результаты тестирования расшифровываются подобным образом:

Положительный результат говорит о большой концентрации патогена в крови носителя. При этом чем выше показатель, тем серьезнее болен пациент, страдающий ВГС;
Негативные показатели теста свидетельствуют о чрезвычайно низкой концентрации гепатовируса в крови человек. Если гепатит С ПЦР не обнаружено, для последующей терапии следует выявить предельный порог чувствительности биологического материала пациента к различным реагентам.

После проведенного исследования биоматериала, работниками медицинской лаборатории выносится конкретный вердикт, который в обязательном порядке документируется и архивируется.

Что делать пациенту после получения результатов исследования?

После получения результатов исследования образцов крови, пациенту следует отправиться к лечащему врачу. Самостоятельно делать выводы о своем диагнозе и намечать определенное лечение не рекомендуется категорически.

В зависимости от результатов тестирования, гепатолог назначает ту или иную терапевтическую схему с применением активных противовирусных препаратов. В зависимости от определенного аналитическим образом генотипом ВГС, могут назначаться следующие схемы лечения этого опасного заболевания:

Софосбувир в сочетании с Ледипасвиром при 1, 4, 5 и 6 генотипах;
Софосбувир и Даклатасвир – при 1, 2, 3 и 4;
Софосбувир в сочетании с Велпатасвиром – при любом из известных генотипов патогена.

В зависимости от общего состояния организма, концентрации гепатовируса и особенностей поражения, может назначаться терапия длительностью в 12 или 24 недели, с применением Рибавирина или без такового. Пациенту следует приобрести лекарства на весь терапевтический период, так как прерывать его нельзя ни в коем случае.

Однако вовсе не обязательно копить деньги на дорогие американские лекарства – можно приобрести более дешевые индийские аналоги. Эти препараты изготавливаются по официальной рецептуре. Более низкая стоимость связана с возможностью массового производства препарата. При этом индийские производители настолько уверены в высоком качестве своей продукции, что предоставляют своим покупателям любые гарантии. К примеру, Zydus Heptiza предлагает Гарантию Выздоровления. Это – документ, согласно которому пациент имеет право на повторное лечение за счет компании, если предыдущая терапия не помогла.

Важно! После приобретения лекарства больному необходимо полностью следовать рекомендациям лечащего врача и ежедневно употреблять лекарство в течение всего терапевтического периода.

Где можно сдать качественный анализ на ПЦР?

Итак, ответ на вопрос «Анализ ПЦР на гепатит С как сдавать?». Также известно, что делать пациенту после соответствующего обследования. Но остается еще одна дилемма – где именно можно сдать кровь на анализ ПЦР на гепатит С качественный.

По большому счету, в нашей стране пройти диагностику рассматриваемого типа можно:

В государственных поликлиниках;
В частных клиниках с обслуживанием эксклюзивного уровня;
В больницах и клиниках стационарного типа;
В независимых медицинских лабораториях.

Также анализ крови ПЦР гепатита С можно сдать и в зарубежных клиниках и лабораториях. Этот метод исследования относится к стандартным.

Что еще следует знать о качественном анализе крови на гепатит С?

При возникновении необходимости ПЦР-диагностики гепатита С следует знать некоторые особенности этой формы тестирования. В частности:

Результаты рассматриваемого анализа крови могут быть положительными на ВГС уже на 4-5 сутки после инфицирования. Белковые соединения формируются позже;
При расшифровке результатов качественного анализа крови на гепатит С рядом с генотипом патогена может стоять буква. Например, «1а». Это обозначение субтипа, которое никоим образом не влияет на особенности терапии;
Результаты тестирования предоставляются очень быстро. Уже на следующие сутки после проведения диагностики пациент получает соответствующий документ;
Одновременно с данным тестом кровь берется и для обследования ИФА.

Бытует мнение насчет качественного анализа на гепатит С, что это исследование крови пациента не является самым лучшим способом определения уровня типа ВГС. Это мнение верно лишь отчасти, потому что диагностика должна быть комплексной.

Оцените статью:

| Всего голосов: 1 Средняя оценка: 5

Вирус гепатита С (Hepatitis C Virus), качественное определение РНК (ультрачувствительный метод)

Метод исследования: ПЦР

Вирусный гепатит С (ВГС) — инфекционное заболевание с парентеральным механизмом передачи, возбудителем которого является РНК-содержащий вирус гепатита С. Инкубационный период — в среднем 6-8 недель. Заболевание характеризуется высокой частотой формирования хронических форм и последующим развитием цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы.

Выявление РНК ВГС является подтверждением острого или хронического гепатита С. Тест используется для диагностики ВГС-инфекции на ранних сроках инфицирования, оптимален для тестирования донорской крови и оценки ответа на противовирусное лечение.

ПОКАЗАНИЯ К ИССЛЕДОВАНИЮ:

Диагностика скрытых (латентных) форм вирусных гепатитов В и С;

Оценка эффективности проводимой противовирусной терапии;

Раннее выявление острых вирусных гепатитов В и С у контактных лиц.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Референсные значения (вариант нормы):

Параметр	Референсные значения	Единицы измерения
РНК HCV (качественное ультрачувствительное исследование)	Не обнаружено

Комментарий к РНК HCV: Аналитическая чувствительность исследования для определения РНК вируса гепатита С -10 МЕ/мл.

Выявление РНК вируса гепатита С — доказательство инфицированности ВГС.

Результаты лабораторных исследований при различных вариантах инфекции, вызванной ВГС*
Клиническая ситуация	anti-HCV	РНК ВГС
Острый гепатит С Хронический гепатит С (РНК ВГС персистирует в сыворотке более 6 месяцев)	+	+
Острый гепатит С Ложноположительные и ложноотрицательные результаты исследования Разрешение острого гепатита С Пациенты с острым или хроническим гепатитом С, которым успешно была проведена терапия	+	-
Ранняя стадия острого гепатита С Хронический гепатит С Ложноположительный результат на РНК ВГС (редко)	-	+
Отсутствие инфицирования вирусом гепатита С	-	-

*Рекомендации по диагностике и лечению взрослых больных гепатитом С, 2013.

Обращаем Ваше внимание на то, что интерпретация результатов исследований, установление диагноза, а также назначение лечения, в соответствии с Федеральным законом № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21 ноября 2011 года, должны производиться врачом соответствующей специализации.

Качественный анализ ПЦР на гепатит С

Гепатит С относится к вирусному поражению печени. Часто это заболевание переходит в хроническую форму. Человек заражается через кровь, половым путем, возможно инфицирование от матери к плоду.

Для диагностики этой болезни выполняют анализ крови на ПЦР (полимеразную цепную реакцию). Исследование на определение вируса бывает количественное и качественное.

Качественный анализ ПЦР на гепатит С помогает обнаружить возбудителя в крови. Количественный — показывает количество этого вируса.

О чем я узнаю? Содержание статьи…

Что такое качественный анализ ПЦР?

Он используется для установки диагноза хронического вирусного гепатита С и определения генотипа его возбудителя. Метод ПЦР относится к высокоточному способу молекулярной диагностики. Он способен определять даже малую концентрацию имеющегося вируса (10 — 500 МЕ/мл).

При острой фазе болезни качественный анализ определяет наличие патологии уже через 1 — 2 недели после заражения. В этот период специфические антитела к вирусу могут еще не выработаться, и проведение иммуноферментного анализа (ИФА) может быть бесполезно. Этот возбудитель имеет высокую мутационную активность. При помощи качественного метода ПЦР определяют, какой генотип болезни развивается у данного пациента.

Когда делается качественный ПЦР на гепатит С?

Качественный ПЦР проводится:

При обнаружении антител при ИФА.
Для диагностики сопутствующих поражений печени. Иногда выявляются смешанные инфекции: одновременно заражение гепатитом B, C и D.
Для выявления генотипа возбудителя с последующим определением тактики лекарственной терапии.
Чтобы верифицировать диагноз.
Для оценки качества лечения и изменений на фоне медикаментозной терапии.

К преимуществами качественного метода исследования относится высокая чувствительность методики, большая скорость диагностики (анализ выполняется от 8 до 24 часов) и выявление скрытого течения заболевания.

Качественный анализ выполняют сразу после обнаружения антител, затем на 4, 12, 24 неделе противовирусной терапии. Потом повторяют через 6 месяцев после завершения лечения и ежегодно.

Анализ ПЦР на гепатит С обязательно выполняют беременным женщинам, донорам, при подготовке к любому оперативному вмешательству.

Группы риска

К людям, находящимся в группе риска инфицирования вирусным гепатитом C, относятся:

Наркоманы, которые вводят наркотики парентерально (внутривенно или внутримышечно).
Лица нетрадиционной сексуальной ориентации.
Дети, рожденные от матерей наркоманок или болеющих гепатитом С.
Больные хронической почечной недостаточностью и постоянно находящиеся на гемодиализе.
Лица после трансплантации внутренних органов: печени, почек, сердца.
Пациенты, нуждающиеся в частых оперативных вмешательствах, заборах крови и инъекциях.
Люди, которые ведут беспорядочную половую жизнь.
Врачи, медработники, постоянно контактирующие с кровью.
Люди, делающие татуировки.

По данным ВОЗ хроническим вирусным гепатитом C в мире страдают 70 миллионов человек, ежегодно умирают от этого заболевания 399.000 людей. 25 млн являются носителями вируса.

Хронические гепатиты могут протекать абсолютно бессимптомно. При начальной стадии заболевания отсутствуют признаки поражения печени либо общие проявления интоксикации.

Необходимо как минимум один раз в год проверять кровь на вирусные гепатиты B и C. Врачи, медицинские сестры, военнослужащие, полицейские, работники силовых структур проходят такое исследование два раза в год.

Методика проведения качественного ПЦР

Для выполнения качественной полимеразной цепной реакции у пациента берется кровь из вены. Затем проводится лабораторное исследование следующим образом: в исследуемый материал добавляют праймеры (короткие химически синтезированные олигодезоксирибонуклеотиды) или специальные ферменты.

С помощью специального прибора охлаждают и нагревают пробирки с кровью. Создается специальная искусственная среда, в которой размножается генетически материал возбудителя до такой степени, что его можно визуально исследовать. При качественном анализе происходит копирование цепей, которые соответствуют вирусной RNA. Затем делается заключение о наличии вируса гепатита в организме пациента.

Перед проведением качественной ПЦР на гепатит С перед исследованием необходимо:

Избегать физических нагрузок за день до сдачи анализа.
Прийти натощак, не употреблять пищу за 8 — 10 часов до сдачи анализа.
Производить забор крови в первой половине дня.
За два дня до проведения диагностики исключают жирную, жареную пищу, алкоголь.

Суть качественной полимеразной цепной реакции заключается в многократном увеличении фрагментов вирусных частиц.

Расшифровка результатов анализа

После проведения качественной ПЦР, в бланке анализа пишется «обнаружено» или «не обнаружено».

Отрицательный результат наблюдается, когда вирус присутствует в крови в малом количестве и чувствительная тест-система не смогла определить концентрацию. Такое наблюдается при недавнем заражении либо при длительно проводимой противовирусной терапии.

Обнаружено

В исследуемом материале определяется РНК HCV (возбудитель). Диагноз гепатита C подтвержден.

Не обнаружено

Возбудитель отсутствует или количество недостаточно для определения.

Расшифровка качественного анализа ПЦР не представляет затруднений. Однако при получении положительного результата необходимо обратиться к гепатологу или инфекционисту для уточнения диагноза и назначения противовирусной терапии.

Что делать, если ПЦР на гепатит С положительный?

Иногда выявляются ложные показатели качественной ПЦР.

Это бывает при некоторых ситуациях:

Воздействие на исследуемые жидкости высокой температуры.
Погрешности работы лаборанта или медицинской сестры.
Постоянное употребление пациентом антикоагулянтов.
Присутствие в крови веществ — ингибиторов ПЦР, которые затрудняют проведение полимеразной реакции.

Если нет никаких сомнений в результате, либо повторные проведенные исследования показали такой же результат, то пациенту ставится диагноз хронического вирусного гепатита C.

Для определения степени поражения и нарушения работы печени, выполняют дополнительные методы обследования: клинические анализы, определение уровня билирубина, трансаминаз, общего белка, щелочной фосфатазы, гамма – глутамилтрансферазы, УЗИ и биопсию печени. Проводится количественная ПЦР диагностика и генотипирование вируса.

Положительный эффект при лечении вызывает применение рибавирина, интерферона — альфа. Обязательно назначаются гепатопротекторные препараты: эссенциале, гептрал, урсосан, иммуномодуляторы.

Пациентам ни в коем случае нельзя отказываться от противовирусного лечения. Это чревато развитием серьезных осложнений, которые приведут к летальному исходу.

Качественная полимеразная цепная реакция относится к высокоточным анализам. Диагностика с помощью ПЦР выявляет даже небольшое количество возбудителя. Это приводит к раннему диагностированию гепатита С и своевременному назначению лечения. При адекватной терапии полное выздоровление наступает у 20% больных.

Расшифровка количественного анализа ПЦР на гепатит С

Вирус гепатита С широко распространен и быстро мутирует, но при этом его можно контролировать. Современные препараты могут даже дать возможность избавиться от него навсегда. Но для этого нужны методы диагностики, которые позволяют максимально точно исследовать болезнь. Одним из таких является полимеразная цепная реакция.

Содержание статьи:

Общие сведения о гепатите

Вирус гепатита С вызывает заболевание, поражающее печень. Он содержит только рибонуклеиновую кислоту и характеризуется быстрой мутацией, что затрудняет терапию. У вируса имеется 6 генотипов и несколько субтипов, что делает на сегодня невозможным создание вакцины. Главный путь распространения — трансфузионный, гепатитом заражаются при переливании крови, трансплантации органов, через нестерильные косметические и хирургические инструменты. Реже встречается передача от матери к плоду и при вагинальном половом акте.

Острый вирусный гепатит преимущественно протекает без симптомов и часто остается невыясненным. Лишь у 15% болезнь проявляется остро и сопровождается тошнотой, уменьшением веса. В хроническую форму патология переходит в 60-85% случаев, намного чаще чем при гепатите В. У 20-30% развиваются осложнения: злокачественные опухоли, цирроз, фиброз, печеночная недостаточность. Продолжительность терапии и вероятность серьезных последствий зависит от генотипа.

Что такое ПЦР и виды исследований

Норма количественного анализа на гепатит С позволяет оценить присутствие вируса в крови. Суть ПЦР в копировании его РНК под воздействием специальных реактивов и выявление даже самых небольших концентраций. Если генетическая информация отсутствует, то она не копируется и соответственно не определяется.

Анализ на присутствие иммуноглобулинов дает возможность подтверждения факта заражения, а также изучения активности процесса и прогнозирования итога лечения. Антитела определяются как в крови больных, так и выздоровевших. Позитивный результат ПЦР говорит об активном размножении вируса. Однако для полной картины рекомендуется сочетать две методики:

Количественный тест. Применяетсядлявычисленияконцентрациивирусавкрови. Данныесведениянеобходимыдляанализавероятностиинфицированиядругихлюдейиопределенияэффективностилечения. ПЦРназначаетсявовремятерапиидляконтроля, а такжеприостройформеболезнидляпредсказаниярискахронизации. Преимущественноколичественный анализ гепатита С проводитсятотчас жепослеобнаруженияворганизмеантителквирусу.
Качественный тест. Результат дает возможность получить два варианта ответа: обнаружено или нет. Норма — отрицательный показатель. Положительный говорит о размножении вируса. Качественное исследование ПЦР на вирус гепатита C должны проходить все пациенты с антителами к этому заболеванию.

Необходимость проведения анализа при гепатите

ПЦР на гепатит С количественный оценивается для последующего подтверждения диагноза, прогнозирования развития болезни, отслеживания и принятия поправок в тактику терапии. Вирусная нагрузка отображает инфекционность. Большая концентрация повышает риск передачи гепатита и негативно воздействует на лечение. Малая нагрузка в этом случае лучше поддается коррекции. Значение результатов определяет продолжительность курса интерфероновой терапии.

Если наблюдается хороший ответ и низкая вирулентность (расшифровка количественного анализа на вирус гепатита С дает результат не более 2*10 6 Копий/мл), то продолжительность лечения может быть значительно сокращена, но при необходимости ее могут и продлить. Эффективная терапия должна приводить к тому, что уровень вирусной нагрузки уменьшается.

Расшифровка количественного исследования

Анализ сдается натощак, специальной подготовки не требуется. Если произошло предполагаемое инфицирование, не стоит проводить тест ранее, чем через 2 недели после контакта.

На выполнение анализа необходимо время, определяющееся уровнем оборудования (несколько часов или дней). После его окончания пациенту выдается бланк с расшифровкой результатов совместно с референтными значениями (нормативами). Следует сравнить свои показатели с предложенной документацией лаборатории, но почти во всех случаях данные анализа оцениваются следующим образом.

Таблица. Расшифровка количественного анализа на гепатит С.

	Значение копий/мл (МЕ/мл)	Присутствие РНК вируса	Примечание
Норма	Отрицательно	Не обнаружено	Нормальное значение РНК вируса или ниже границы восприимчивости
Патология	до 7,4102 (1.5103)	Обнаружено	Концентрация низкая
	до 2106 (4106)		Вирусная нагрузка низка, хорошо поддается лечению
	более 2106 (4106)		Высокая виремия
	более 1108 (2108)		Концентрация больше линейного диапазона, прогноз неблагоприятный

Преимущества ПЦР-исследования

Основное преимущество проведения ПЦР диагностики – точное определение наличия возбудителей. Метод рассчитан на выявление рибонуклеиновой кислоты, чем он и разнится от других, оценивающих косвенные признаки и дающие исключительно опосредованное доказательство присутствия инфекции.

Большая специфичность обусловлена тем, что исследуется уникальный фрагмент ДНК. Это позволяет исключить ложноположительные результаты, в отличие от ИФА (анализа на иммуноглобулины). ПЦР-метод подобен размножению бактерий на средах, в которых их количество под действием определённой среды увеличивается в миллионы раз. Праймеры, устанавливающие специфичность методики, могут быть предназначены для семейства микроорганизмов или для конкретного вида.

Важно знать! Высокая чувствительность количественного исследования позволяет выявить норму РНК вируса гепатита С в биологическом образце от 1 до 10 микроорганизмов при большой специфичности. Автоматизация процесса приводит к тому, что анализ может быть готов всего за 4-5 часов.

Проводится исследование в любых государственных и частных лабораториях («Инвитро», ЦМД). Расшифровывать результат должен исключительно врач.

Как часто нужно проводить ПЦР-анализ

Обычно количественный анализ на гепатит С делается перед началом терапии, на 12 и 24 неделе лечения, и ежегодно после его завершения. Выдается результат, который показывает, удалось ли прибору обнаружить вирус и в каком количестве. Применяется ПЦР и для оценки эффективности лечения и в том случае, если качественный метод не определяет возбудителя при позитивном анализе на иммуноглобулины.

Отрицательный результат количественного анализа ПЦР на гепатит С при присутствии иммуноглобулинов, свидетельствующих об острой фазе патологии, может говорить о том, что концентрация вируса ниже предельной чувствительности прибора. Но это при условии, что ИФА был проведен верно.

На сегодня болезнь успешно лечится современными препаратами. Но чтобы взять под контроль заболевание, нужно располагать сведениями о вирулентности у каждого конкретного пациента, что и делается при помощи количественного ПЦР на гепатит С.

сдача анализа и диагностика. Методы определения результатов.

ПЦР на гепатит C – исследование, позволяющее поставить человеку с подозрением на это сложное и опасное заболевание точный диагноз.

Как и всякий анализ, методика имеет ряд показаний, по которым проводится, а также свои, характерные особенности. Что это за болезнь – гепатит C, часто спрашивают пациенты у своих лечащих врачей, и в чем особенности ПЦР-диагностики. Какие виды анализа используются в медицинской практике, и каковы особенности расшифровки?

Что это за болезнь

Гепатит C – заболевание, вызываемое особым вирусом. При попадании в организм патоген в первую очередь вызывает поражения печени, которые характеризуются, как необратимые. Из-за этого недуг относят к тяжелым инфекциям. Частый исход заболевания – цирроз, что в свою очередь приводит к гибели человека.

Патогенез кажется довольно простым. Вирус, попав в клетки печени, начинает в них активное размножение. При этом, как только концентрация вируса в одной клетки достигает предела, клетка погибает, а патоген высвобождается. Происходит вовлечение в процесс ранее здоровых структур. На месте погибших тканей формируется соединительная ткань, которая не обладает способностью выполнять те же функции, что и здоровые печеночные клетки.

Цирроз, развивающийся из-за воздействия вируса, хорошо известен своими негативными эффектами. Он провоцирует скачки давления в портальной вене, негативно влияет на свертываемость крови, становится причиной желудочно-кишечных кровотечений. Сам возбудитель относится к группе РНК-содержащих вирусов.

Это значит, что в нем отсутствуют ДНК-структуры, а воспроизведение биологического материала идет по модели РНК.

Вирус характеризуется небольшими размерами.

Как происходит заражение, интересуются часто пациенты на врачебном приеме.

Существует несколько вариантов.

Парентеральный

Путь реализуется достаточно часто, но не все пациенты понимают, что зашифровано под этим словом.

На самом деле все просто. Под парентеральным путем передачи понимают способность вируса распространяться через кровь. Люди ошибочно полагают, что главную угрозу несут препараты крови, используемые при переливании, но это далеко от истины.

На самом деле, как отмечают доктора, гораздо чаще заражение происходит через загрязненный хирургический инструментарий. Еще чаще через оборудование, используемое в косметологических, татуировочных или пирсинг-салонах.

Вся донорская кровь сегодня проверяется на вирус гепатита C, однако при экстренном переливании заражение все же возможно.

Половой

Вариант передачи через сексуальные контакты считается самым распространенным. Вирусные частицы содержатся у людей в сперме, в вагинальных выделениях. Естественно, при незащищенном контакте передача возбудителя – дело времени.

Как отмечают доктора, вероятность заражения тем выше, чем чаще происходили половые контакты с инфицированным человеком.

Вертикальный путь

Патогенный микроорганизм практически не способен к проникновению сквозь плаценту, однако он легко инфицирует ребенка во время его прохождения по родовым путям. Если заражение произошло, вылечить малыша уже нельзя, так как на сегодняшний день эффективных средств от этого вируса не существует.

Есть только медикаменты, снижающие его активность. Их прием во время беременности позволяет родить здорового ребенка.

Вероятность контактно-бытовой передачи вируса сведена практически к нулю. В моче, слюне, слезной жидкости гепатит C присутствует, однако его концентрация там очень мала.

Заражение может произойти только при соблюдении целого ряда определенных условий.

Вирус гепатита C – патоген, отличающийся выраженным коварством. Дело в том, что микроорганизм способен в течение приличного отрезка времени существовать в организме, не провоцируя реакции выработки антител со стороны иммунитета. Из-за этого его диагностика с помощью ИФА методики неэффективна на ранних стадиях развития заболевания.

Что представляет собой ПЦР-исследование

Далеко не все пациенты представляют себе, что такое ПЦР методика.

Почему она используется с большей эффективностью на ранних этапах развития гепатита C, чем метод иммуноферментного анализа?

Полимеразная цепная реакция – метод, пришедший в инфекционные болезни из молекулярной биологии. Использовать его для выполнения анализов стали не так давно. Если ИФА обнаруживает в организме пациента антитела, которые вырабатываются иммунной системой, то ПЦР нацелена непосредственно на генетический материал вируса.

Следовательно, определить заражение можно на ранних стадиях, когда иммунитет еще не успел среагировать на попадание в него патогена.

Чтобы провести исследование, доктору необходимо взять кровь пациента. Именно в ней содержится РНК-вирус в высоких концентрациях. В кровь добавляются специальные вещества, называемые праймерами. Они реагируют со строго определенными фрагментами РНК. При добавлении фермента, называемого РНК-полимеразой, начинается копирование выделенных фрагментов.

После того, как процесс копирования подойдет к концу, доктора с помощью специальных баз сопоставляют полученные результаты с известными РНК-частицами После чего выставляют окончательный диагноз. Естественно, критерий диагноза – наличие совпадений.

Виды анализа

ПЦР не так давно используется в медицине.

Однако уже сейчас доктора прилагают максимум усилий для того, чтобы извлечь из методики наибольшее количество пользы. Так, например, именно в медицине произошло совершенствование полимеразной цепной реакции, появились новые разновидности этого исследования.

Три из них используются для диагностики гепатита C.

Качественный анализ

Самый простой тип исследования. С его помощью просто устанавливают факт наличия вируса в организме. Следовательно, в графе отмечают только положительность или отрицательность выполненной реакции.

Количественный анализ

Чуть более сложная, но и более информативная методика. Позволяет не просто сказать, есть патогенный микроорганизм в крови, но и определить его концентрацию.

Определение концентрации необходимо докторам перед началом лечения, а также для контроля эффективности терапии. Определяют в ходе него количество частиц вируса в 1 мл крови.

Генотипирование

Сегодня в медицине выделяется 7 типов вируса гепатита C. При этом никто не даст гарантии того, что в ближайшее время не появятся новые разновидности, так как патоген обладает способностью к быстрой мутации.

На территории РФ чаще всего встречаются первые три генотипа. Именно на определение, того, каким именно генотипом заражен пациент, направлено генотипирование. От выявленного генотипа зависит выбор терапии, ее эффективность, дальнейший прогноз. Так, например, достоверно известно, что второй и третий генотипы менее устойчивы к лечению, чем первый.

Особенности расшифровки

Расшифровка результатов исследования в большинстве случаев не представляет сложностей. Правда, даже не смотря на видимую простоту, доверять ее необходимо доктору.

Дело в том, что даже если гепатит C ПЦР отрицательный, не факт, что вирус отсутствует в крови. Аналогична ситуация с положительными результатами, так как возможны ложноположительные и ложноотрицательные реакции.

Чтобы заподозрить ложность результатов, доктор должен оценивать результаты вкупе с клинической картиной.

Качественный анализ оценить проще всего. Если в графе результата значится минус или надпись «отрицательно», значит заражение отсутствует, пациент здоров. Если минус заменен на плюс или на слово «положительно», значит вирус есть в крови, и необходимо начинать терапию.

Расшифровка количественного анализа чуть более сложная. В норме ни одной вирусной частицы в миллилитре крови обнаружено не будет. Если в крови обнаружен 1,8*10 во второй степени МЕ/мл – это повод заподозрить заражение, но еще не поставить окончательный диагноз. В этом случае важно соотнести результаты не только с общим состоянием пациента, но и с данными других исследований. Так как они могут указывать как на раннюю стадию болезни, так и быть ложными.

Если определяется нагрузка, превышающая отметку 8*10 в 5 степени, говорят о высоком уровне нагрузки. Он представляет серьезную опасность для жизни пациента и требует срочного снижения. Расшифровка результатов генотипирования также обычно не представляет сложностей. Чаще всего в исследовании при заражении обнаруживается один из трех характерных для России гепатитов (1, 2 или 3).

Если обнаружен генотип, нехарактерный для РФ, то в анализах указывается, что РНК вируса есть, но не обозначается конкретный генотип. В этом случае требуются дополнительные исследования, чтобы исключить ошибки в выборе оптимального лечения.

Преимущества ПЦР

Полимеразная цепная реакция – методика, получившая широкое распространение в диагностике гепатита C.

Связано это с рядом ее преимуществ перед другими диагностическими методиками.

Врачи называют среди преимуществ:

Возможность поставить диагноз на ранних стадиях болезни. Подобная возможность обеспечивается за счет того, что исследование выявляет не продукты реакции организма, как в случае с ИФА, а непосредственно частицы вируса. Промежуток меду заражением и появлением антител может быть очень большим, а вот обнаружение частиц вируса в кровеносном русле возможно практически сразу после заражения.
Небольшая вероятность получения ложных результатов. ПЦР – высокоточный метод, обладающий еще и высокой специфичностью. Ошибки из-за реакции на схожие антитела, так характерные для ИФА, для него несвойственны. Также нельзя забывать о том, что большая часть работы выполняется оборудованием, а значит воздействие человеческого фактора сведено к минимуму.
Высокая чувствительная способность. Полимеразная цепная реакция способна обнаруживать вирусные частицы даже в том случае, если их количество в кровеносном русле минимально. Благодаря этому можно определить скрытые инфекции.

Особенности подготовки к исследованию

Чтобы выполнить анализ на гепатит C с помощью ПЦР, доктор берет у больного венозную кровь. При этом пациенту рекомендуется пройти элементарную подготовку к исследованию, которая повысит его точность.

Стоит соблюсти следующие простые правила:

прийти в кабинет для сдачи крови стоит в утреннее время, так как в этот период концентрация вирусных частиц в крови максимальна;
перед посещением кабинета не стоит принимать пищу в течение минимум 8-10 часов;
рекомендована легкая диета на 2-3, исключающая употребление вредной пищи, алкогольной продукции;
от курения стоит отказаться минимум за полчаса до исследования, а лучше не курить в течение суток накануне;
физические нагрузки и психоэмоциональные стрессы подлежат исключению.

Соблюдение подготовительных правил поможет получить точные результаты, снизит риск столкновения с ложными реакциями.

Что делать, если анализ положительный

Пациенты нередко задаются вопросом о том, что им делать, если анализ оказался положительным.

В первую очередь необходимо прекратить паниковать. Любой грамотный врач, увидев положительные результаты, назначит повторные исследования и дополнительные анализы для того, чтобы убедиться в отсутствии ошибки. Только после получения повторных результатов можно будет делать какие-то выводы. Если даже повторное исследование оказалось положительным, необходимо начинать лечение под врачебным контролем.

Гепатит C – опасное заболевание, препараты от которого стоят недешево.

Однако терапия, позволяющая если уж не победить вирус полностью, то значительно замедлить его прогрессирование, все же существует. И нельзя от нее отказываться.

Лечение под врачебным контролем сохранит пациенту здоровье, а может даже полностью избавит его от опасной инфекции.

Гепатит C – коварный недуг, способный приводить к летальному исходу. Его диагностика с помощью ПЦР – хорошее подспорье в раннем начале терапии, без которого смертность была бы значительно выше!

A фитотерапия подавляет секрецию поверхностного антигена гепатита B в трансфицированных клетках гепатокарциномы человека PLC / PRF / 5

HD-03 / ES — это травяной состав, используемый для лечения гепатита B. Однако молекулярный механизм, участвующий в антигепатите B ( HBV) активность этого препарата не изучалась на моделях in vitro . Влияние HD-03 / ES на секрецию поверхностного антигена гепатита B (HBsAg) и экспрессию его гена изучали на трансфицированных клетках гепатокарциномы человека PLC / PRF / 5.Активность против HBV тестировалась на основании ингибирования секреции HBsAg в культуральную среду, что было обнаружено с помощью HBsAg-специфического антител-опосредованного ферментного анализа (ELISA) в концентрациях от 125 до 1000 мкг / мкг / мл. Влияние HD-03 / ES на экспрессию гена HBsAg анализировали с помощью полуколичественной мультиплексной RT-PCR с использованием специфических праймеров. Результаты показали, что HD-03 / ES подавлял продукцию HBsAg с IC ₅₀ 380 μ мкг / мл в клетках PLC / PRF / 5 в течение 24 часов.HD-03 / ES подавлял экспрессию гена HBsAg в клетках PLC / PRF / 5. В заключение, HD-03 / ES проявляет сильные анти-HBV свойства, подавляя секрецию поверхностного антигена гепатита B клетками PLC / PRF / 5, и это действие нацелено на уровень транскрипции. Таким образом, HD-03 / ES может быть полезным при лечении острых и хронических инфекций гепатита B.

1. Введение

Инфекция, вызванная вирусом гепатита B (HBV), является серьезной проблемой здравоохранения во всем мире, затрагивая более 350 миллионов человек, которые являются носителями этого вируса, который может вызывать хронический гепатит, цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному [1] .После инфицирования HBV появляются различные серологические маркеры, и первым из них является HBsAg (поверхностный антиген гепатита B), который наблюдается за две-три недели до появления клинических и биологических симптомов. Распространенность HBsAg в Индии колеблется от 1 до 13 процентов, в среднем 4,7 процента [2–4]. Молекулярная диагностика, выявляющая HBsAg в образцах сыворотки, играет важную роль в ранней диагностике инфекции гепатита B (HB).

PLC / PRF / 5 представляет собой непрерывную линию клеток гепатокарциномы человека, геном которой содержит интегрированную ДНК HBV и секретирует два белка оболочки вируса гепатита B [5].Клетки могли непрерывно секретировать HBsAg в культуральную среду [6, 7]. Эти клетки подходят для изучения влияния лекарств на экспрессию и секрецию HBsAg [6]. Поскольку клетки не продуцируют инфекционные частицы вирионов, с клеточной линией безопасно работать с защитой уровня 2 биобезопасности [8].

В настоящее время доступно несколько противовирусных препаратов для лечения ВГВ, в том числе IFN- α , ламивудин, энтекавир, телбивудин и тенофовир. Однако терапия интерфероном имеет ограниченную эффективность, медленное действие и часто вызывает побочные эффекты [9].Интерферонотерапия эффективна только у 30-40% пациентов с хронической инфекцией HBV. Обнаруживаются нежелательные побочные эффекты лечения интерфероном, такие как лихорадка, недомогание, усталость, депрессия, выпадение волос, нейтропения и тромбоцитопения [10]. Ламивудин также вызывает ответ у небольшой части пациентов и вызывает несколько побочных эффектов [11]. Кроме того, противовирусные препараты и интерферон дороги.

Травяные соединения растительного происхождения являются ведущими для открытия новых лекарств от инфекционных и неинфекционных заболеваний.Сообщалось, что несколько сотен видов растений обладают противовирусными свойствами, и некоторые из них использовались для лечения пациентов [12]. HD-03 / ES — это новый травяной состав, используемый для лечения инфекций HBV, который продается как Liv.52 HB. HD-03 / ES представляет собой капсульную форму, состоящую из 125 мг водно-спиртовых экстрактов корней трав, Cyperus rotundus и Cyperus scariosus . Анти-HBV активность HD-03 / ES описана несколькими исследователями [13–15].Однако молекулярный механизм, лежащий в основе анти-HBV активности HD-03 / ES, недостаточно изучен in vitro . В настоящем исследовании изучалось влияние HD-03 / ES на ингибирование секреции HBsAg и экспрессию его гена в клетках PLC / PRF / 5.

2. Материалы и методы

2.1. Материалы.

Клетки

PLC / PRF / 5 были получены из Национального центра клеточных исследований (NCCS), Пуна. Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), фетальная бычья сыворотка (FBS), 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ), реагент TRI и специально приготовленные олигонуклеотиды. получен от Sigma Chemical Co.(Сент-Луис, Миссури, США). Набор для ELISA HBsAg Ultra был приобретен в компании Bio-Rad, Франция. Пенициллин и стрептомицин были от Hi-media, Мумбаи, Индия. Обратная транскриптаза вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV), dNTP и ДНК-полимераза Taq были получены от MBI Fermentas (Glen Burnie, MD, США).

2.2. Экстракция HD-03 / ES.

Гранулы HD-03 / ES были получены из отдела рецептуры и разработки компании Himalaya Drug Company, Индия. Около 100 г гранул HD-03 / ES помещали в экстракционный аппарат Сокслета.Материал экстрагировали метанолом в течение 8 часов при 80 ° C. Экстракт концентрировали с помощью роторного испарителя. Сухой остаток подвергали исследованиям in vitro .

2.3. Культура клеток и анализ цитотоксичности

Клетки PLC / PRF / 5 культивировали в среде с высоким содержанием глюкозы DMEM с добавлением 10% FBS, 100 МЕ пенициллина и 100 мкг г стрептомицина на мл при 37 ° C и 5% CO ₂ . Клетки PLC / PRF / 5 с плотностью 2 × 10 ⁵ мл высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи при 37 ° C и 5% CO ₂.HD-03 / ES растворяли в 0,5% ДМСО в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы и использовали в экспериментах. Клетки обрабатывали различными концентрациями HD-03 / ES в культуральной среде и инкубировали в течение 24 часов при 37 ° C и 5% CO ₂ для определения цитотоксичности экстракта. Также сохранялись клеточный контроль и контроль носителя. Жизнеспособность клеток проверяли с помощью анализа МТТ после воздействия на клетки 1 мг / мл МТТ в течение 3 часов при 37 ° C. Синий формазановый продукт растворяли в ДМСО и измеряли оптическую плотность при 540 нм [16].Нетоксичные концентрации HD-03 / ES были использованы для дальнейших экспериментов.

2.4. Обнаружение HBsAg

Клетки PLC / PRF / 5 в концентрации 5 × 10 ⁴ мл высевали в 24-луночный планшет и инкубировали в течение ночи при 37 ° C. Клетки обрабатывали четырьмя нетоксичными концентрациями HD-03 / ES и инкубировали в течение 24 часов при 37 ° C и 5% CO ₂. В конце периода инкубации супернатант собирали центрифугированием при 1000 об / мин в течение 10 мин при 4 ° C. Супернатант собирали в свежий 1.Микроцентрифужная пробирка на 5 мл и хранится при -20 ° C для ELISA. Осадок клеток хранили при -80 ° C для выделения РНК.

Диагностический набор для HBsAg (ELISA) от BioRad, Франция, использовался для обнаружения HBsAg в культуральной среде. Анализ проводился в соответствии с протоколом производителя. Оптическую плотность измеряли при 450 нм для определения HBsAg, присутствующего в образцах. Процент ингибирования HBV HD-03 / ES рассчитывали по сравнению с клеточным контролем.

2,5. Выделение РНК и ОТ-ПЦР

Общую РНК выделяли из контрольных клеток и клеток, обработанных HD-03 / ES, с использованием реагента TRI, и РНК хранили при -80 ° C.РНК подвергали обработке ДНКазой I (10 мкг г ДНКазы I в течение 5 мин при 65 ° C и охлаждали на льду в течение 1 мин). РНК количественно определяли с помощью спектрофотометра и определяли количество РНК. Один микрограмм РНК подвергали обратной транскрипции с использованием Oligo-dT Primer при 42 ° C, как описано нами ранее [17]. КДНК хранили при -20 ° C для дальнейших реакций ПЦР. Полуколичественная мультиплексная ПЦР была разработана для сравнения продуктов ОТ-ПЦР гена S и гена pre-S с продуктами гена GAPDH для определения относительных уровней экспрессии HBsAg.ПЦР проводили для амплификации HBsAg (S- и pre-S-гены) с использованием специфических праймеров в синтезе второй цепи. Праймеры GAPDH также добавляли в ту же пробирку для каждой реакции ПЦР. Поскольку температуры отжига гена HBsAg и GAPDH были одинаковыми (60 ° C), температура отжига реакции была зафиксирована на уровне 60 ° C. Последовательность праймера для гена S была 5′-CCCAATACCACATCATCC-3 ‘(смысловая) и 5′-GGATTGGGGACCCTGCGC-3′ (антисмысловая). Последовательности праймеров, использованные для pre-S, представляли собой 5’-GGGTCACCATATTCTTGG-3 ‘(смысловой) и 5′-GTCCTAGGAATCCTGATG-3′ (антисмысловой).Для гена GAPDH использовалась последовательность праймера 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘(смысловая) и 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ (антисмысловая). Реакция ПЦР подвергалась денатурации в течение 36 секунд при 95 ° C, затем 25 циклов денатурации при 95 ° C в течение 36 секунд, отжига при 60 ° C в течение 30 секунд и удлинения при 72 ° C в течение 90 секунд. Окончательное удлинение при 72 ° C в течение 10 минут завершало программу ПЦР. Продукты ПЦР анализировали на 2% агарозном геле, окрашенном бромидом этидия, и фотографировали под воздействием УФ-света.Стандартный маркер молекулярной массы был разделен вместе с образцами для дифференциации ампликонов кДНК в агарозном геле. Денситометрический анализ (программа Image J, Rasband, США) был проведен, чтобы найти различия в экспрессии выбранных генов.

3. Статистический анализ

Данные были проанализированы для определения среднего значения ± стандартное отклонение. Статистический анализ данных был выполнен с помощью непарного теста Стьюдента t с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (Сан-Диего, США). значение меньше 0.05 считалось значительным.

4. Результаты

Перед исследованием анти-HBV эффектов любые предполагаемые цитотоксические эффекты экстракта HD-03 / ES на клетки PLC / PRF / 5 были изучены с помощью МТТ-анализа. Результат измерения цитотоксичности экстракта HD-03 / ES на клетках PLC / PRF / 5 показан на рисунке 1. Процент токсичности HD-03 / ES при 2000, 1000, 500, 250 и 125 мкг г / мл оказалось равным 8,75, 1,25, 0,75, 0,25 и 0,00 соответственно в клетках PLC / PRF / 5. Количество HBsAg, секретируемого в среду для культивирования клеток, определяли с помощью ELISA.Четыре нетоксичных концентрации (1000, 500, 250 и 125 мкг мкг / мл) использовали для обнаружения HBsAg в клетках PLC / PRF / 5. Оптическую плотность (OD) считывали при 450 нм с использованием планшет-ридера для ELISA и рассчитывали процент секреции HBsAg клетками, обработанными лекарством, по сравнению с контролем. Каждый эксперимент повторяли трижды, и результаты показали, что HD-03 / ES в концентрациях 1000, 500 и 250 мкг мкг / мл ингибировал секрецию HBsAg на 86,38, 71,17 и 17,1% соответственно по сравнению с контролем. (Фигура 2).При 125 мкг мкг / мл HD-03 / ES не ингибировал HBsAg в клетках PLC / PRF / 5. Однако при более высоких концентрациях HD-03 / ES подавлял продукцию HBsAg в клетках PLC / PRF / 5 с IC ₅₀, равным 380 мк мкг / мл.

Чтобы проверить, направлен ли ингибирующий эффект HBsAg HD-03 / ES на уровень транскрипции, была проведена полуколичественная мультиплексная RT-PCR с использованием РНК, выделенной из HD-03 / ES-обработанных / необработанные клетки. Праймеры, специфичные для S-гена и пре-S-гена, использовали для амплификации гена, кодирующего HBsAg, в клетках PLC / PRF / 5.В результате амплификации были получены специфические кДНК, соответствующие гену S (625 п.н.) и гену pre-S (553 п.н.) (Фигуры 3 и 4). Денситометрический анализ сравнивал уровни экспрессии генов ампликонов по сравнению с GAPDH, внутренним контролем. Результаты показали, что HD-03 / ES при 1000 и 500 мкг мкг / мл подавлял уровни экспрессии HBsAg по сравнению с клеточным контролем. Уровни экспрессии HBsAg в клетках, обработанных экстрактом HD-03 / ES, были ниже, чем в контроле (Фигуры 3 и 4).Внутренний контроль, GAPDH, был равномерно амплифицирован во всех образцах.

ПЦР-тест на РНК гепатита С

Качественный анализ крови с помощью ПЦР РНК гепатита С

Раннее обнаружение вирусов, квалификация

Код теста: 37273

Тип образца: Кровь

Описание:

ПЦР на РНК гепатита С Качественный анализ крови

Качественный ПЦР-тест на РНК гепатита С используется для поиска инфекций, вызванных вирусом гепатита С .Этот тест ищет генетический материал вируса. Поскольку вирусный генетический материал может быть обнаружен раньше, чем антитела, которые развиваются в ответ на инфекцию, можно использовать ПЦР-анализ для скрининга недавнего контакта . Этот тест также полезен в качестве подтверждения для людей, у которых был положительный результат теста на АБС ВГС. Результаты этого теста качественные , что означает, что они будут как положительные, так и отрицательные.

Гепатит С — это вирус, передающийся через контакт с инфицированной кровью .Почти 80% инфекций гепатита С перерастают в хронический гепатит. Число людей во всем мире с хроническим гепатитом С составляет около 150 миллионов. Хронические инфекции гепатита С могут привести к серьезным осложнениям, таким как цирроз и рак печени. Многие инфекции ВГС проявляются без симптомов . Когда симптомы действительно возникают, некоторые из наиболее распространенных включают:

• Лихорадка
• Усталость
• Потеря аппетита
• Тошнота
• Рвота
• Боль в животе
• Моча темного цвета
• Серый кал
• Желтуха (пожелтение кожи или глаз)

Гепатит С может передаваться разными путями.К наиболее распространенным из них относятся внутривенное употребление наркотиков, неправильно очищенные или стерилизованные инструменты для татуировки и пирсинга, половые контакты, переливание крови (до начала 1990-х годов, когда применялись более строгие методы проверки донорской крови) и от инфицированной матери ее младенцу во время рождение.

Качественный тест РНК на гепатит ПЦР чаще всего заказывается как скрининг людьми, недавно имевшими контакт. Качественная ПЦР также назначается в качестве подтверждающего теста для тех, у кого был положительный результат предыдущего теста на ВГС.

Люди, которым требуется тест на вирусную нагрузку с количественными результатами, могут заказать количественный тест ПЦР РНК гепатита С. Тест на антител к гепатиту С может быть назначен в качестве скрининга для людей, которым не требуется недавний тест на контакт.

Срок сдачи ПЦР на РНК гепатита С Качественный анализ обычно составляет 5-7 рабочих дней.

Примечание. Время обработки результатов является приблизительным и не гарантируется. Нашей справочной лаборатории может потребоваться дополнительное время из-за погодных условий, праздников, подтверждения / повторного тестирования или технического обслуживания оборудования.

Инкубационный период:

Тест ПЦР на гепатит С обычно позволяет обнаружить вирус примерно через 3 недели после предполагаемого контакта или контакта или в любое время после него. Некоторых людей можно обнаружить раньше.

Требования:

Это тестирование на гепатит С не имеет каких-либо особых требований.

Категории:

Паспортов безопасности патогенов: инфекционные вещества — вирус гепатита B (HBV)

ПАСПОРТ БЕЗОПАСНОСТИ ДЛЯ ПАТОГЕНОВ — ИНФЕКЦИОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

РАЗДЕЛ I — ИНФЕКЦИОННЫЙ АГЕНТ

НАЗВАНИЕ : Вирус гепатита B (HBV).

СИНОНИМ ИЛИ ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА : HBV ^{Сноска 1-сноска 11}, гепатит B ^{Сноска 1}, инфекция HBV ^{Сноска 1-сноска 3, сноска 11}, гепатит типа B ^{Сноска 4, сноска 12, сноска 13} , сывороточный гепатит, гомологичная сывороточная желтуха, гепатит с австралийским антигеном и HB ^{Footnote 4}.

ХАРАКТЕРИСТИКИ : HBV является членом семейства Hepadnaviridae ^{Footnote 1, Footnote 11}, имеет кольцевой ДНК-геном, который является частично двухцепочечным и частично одноцепочечным и имеет диаметр 42 нм. ^{Footnote 1, Footnote 2, Footnote 4}.HBV состоит из ряда клинически важных вирусных белков, в том числе белка оболочки, поверхностного антигена гепатита B (HBsAg), корового антигена гепатита B (HBcAg) и растворимого белка нуклеокапсида, e-антигена гепатита B (HBeAg). ^{Footnote 3}.

Было идентифицировано восемь генотипов HBV (от A до H) ^{Footnote 2 — Footnote 4, Footnote 10, Footnote 14, Footnote 15}, которые показывают дифференциальное географическое распределение ^{Footnote 2, Footnote 14} и клинических исходов ^{Footnote 14}.Например, генотипы B и C распространены в Азии. ^{, сноска 2, сноска 14,}, в то время как генотипы A и D более распространены в Европе, на Ближнем Востоке и в Индии. ^{, сноска 2,}, а A и C — наиболее распространены на севере. Америка ^{Сноска 14}.

РАЗДЕЛ II — ИДЕНТИФИКАЦИЯ ОПАСНОСТИ

ПАТОГЕННОСТЬ / ТОКСИЧНОСТЬ : Острая инфекция гепатита B : Лица с острой инфекцией гепатита B могут протекать бессимптомно или иметь клиническую картину, варьирующуюся от легкой до тяжелой степени гепатита ^{Footnote 2}.У людей с симптоматической острой инфекцией ВГВ могут проявляться признаки и симптомы, в том числе тошнота, боль в животе, рвота, лихорадка, желтуха, темная моча, изменение цвета стула, гепатомегалия или спленомегалия, а также признаки дисфункции печени. ^{Footnote 1, Footnote 2, Сноска 11}. Исход острой инфекции HBV обычно благоприятен с полным выздоровлением от любого повреждения печени и сероконверсией к анти-HBs, что представляет собой долгосрочную защиту от инфекции HBV. ^{Footnote 2}.

Хроническая инфекция гепатита B : Определяется как персистенция HBsAg более 6 месяцев ^{Сноска 1, Сноска 2, Сноска 6, Сноска 11}. Люди с хронической инфекцией ВГВ могут протекать бессимптомно или страдать от таких симптомов, как усталость, анорексия, тошнота, дискомфорт в животе и дисфункция печени. У них значительно повышен риск развития хронических заболеваний печени, включая цирроз печени и первичную гепатоцеллюлярную карциному. ^{Footnote 11}.

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ : инфекция ВГВ — глобальная проблема здравоохранения ^{Footnote 2, Footnote 4, Footnote 5}. Два миллиарда человек во всем мире инфицированы HBV, 360 миллионов имеют хроническую инфекцию HBV и 600 000 умирают каждый год от заболеваний печени, связанных с HBV, или гепатоцеллюлярной карциномы ^{Footnote 1, Footnote 4}. Инфекция HBV наиболее распространена в Азии, Африке, Южной Европе и Латинской Америке, где распространенность носителей HBsAg в общей популяции колеблется от 2 до 20%. ^{Footnote 2}.В этих регионах инфицирование HBV в основном происходит в детском и раннем младенчестве. Северная Америка, Северная Европа и Океанический регион — районы с низкой распространенностью, где инфекция HBV обычно возникает в подростковом и раннем взрослом возрасте.

ДИАПАЗОН ХОЗЯЙСТВ : Люди — единственный известный естественный хозяин ^{Сноска 1 — Сноска 7, Сноска 9, Сноска 11, Сноска 13}. Шимпанзе восприимчивы как экспериментальные животные ^{Сноска 4, Сноска 9, Сноска 11, Сноска 12, Сноска 16}.

ИНФЕКЦИОННАЯ ДОЗА : Неизвестно.

СПОСОБ ПЕРЕДАЧИ : ВГВ передается через кожный контакт или через слизистые оболочки с инфицированной кровью или другими биологическими жидкостями ^{Сноска 1, Сноска 3, Сноска 4, Сноска 11}. Передача ВГВ наблюдалась при многочисленных формах контакта с людьми, таких как перинатальный контакт / контакт от матери к ребенку, домашний (несексуальный), сексуальный, совместное использование игл и связанный с профессиональным уходом / уходом за здоровьем.

ПЕРИОД ИНКУБАЦИИ : Обычно 24-180 дней (в среднем 60-90 дней) ^{Footnote 2, Footnote 4}. Вариации зависят от количества вируса в инокуляте, способа передачи и других факторов хозяина. ^{Footnote 4}.

КОММУНИКАЦИЯ : Все лица, положительные по HBsAg, потенциально заразны, и кровь может быть заразной в течение нескольких недель до появления клинических симптомов. ^{Footnote 4}.

РАЗДЕЛ III — РАСПРОСТРАНЕНИЕ

РЕЗЕРВУАР : Люди ^{Сноска 1}.

ЗООНОЗ : Нет.

ВЕКТОРЫ : Нет.

РАЗДЕЛ IV — УСТОЙЧИВОСТЬ И ЖЕСТКОСТЬ

ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ : Чувствительность к противовирусным препаратам, таким как интерферон-α, пегилированный интерферон α-2a, ламивудин, адефовир, энтекавир, телбивудин и тенофовир. ^{Footnote 3}.

УСТОЙЧИВОСТЬ К ДЕЗИНФЕКЦИОННЫМ СРЕДСТВАМ : Обработка HBV, разведенная в фосфатно-солевом буфере с 1% неионным детергентом (Triton X-100) плюс 0.3% три-н-бутилфосфата приводит к инактивации HBV ^{Footnote 7}. HBV также инактивируется формальдегидом, глутаровым альдегидом, гипохлоритом натрия (5000 ppm доступного хлора), четвертичными аммониевыми соединениями и спиртами (70-80%). ^{Footnote 8}.

ФИЗИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ : Влажное тепло при 98 ° C в течение 1 минуты частично инактивирует HBV в разведении сыворотки 1:10. ^{Сноска 13}. Инкубация при 60 ° C в течение 10 часов (пастеризация) также деактивирует HVB ^{Footnote 7}.

ВЫЖИВАНИЕ ВНЕ ХОЗЯЙСТВА : HBV может выжить и оставаться заразным на поверхностях окружающей среды не менее 7 дней ^{Footnote 17}.

РАЗДЕЛ V — ПЕРВАЯ ПОМОЩЬ / МЕДИЦИНСКАЯ

НАБЛЮДЕНИЕ : Следите за симптомами. Демонстрация в сыворотке специфических антигенов HB и / или антител (HBsAg, anti-HBs, HBeAg, anti-HBe и anti-HBc) с использованием методов иммуноферментного анализа (например, ELISA) подтверждает диагноз ^{Footnote 15}. Другие тесты включают радиоиммуноанализ ^{Footnote 12}, PCR ^{Footnote 2, Footnote 6}, ПЦР в реальном времени и анализы ДНК без ПЦР ^{Footnote 6}.

Примечание. Не все методы диагностики доступны во всех странах.

ПЕРВАЯ ПОМОЩЬ / ЛЕЧЕНИЕ : После контакта с HBV пораженный участок следует немедленно промыть водой с мылом. Слизистые оболочки и конъюнктиву следует тщательно промыть водой. ^{Footnote 10}. Если известно, что вовлеченный материал содержит HBV или положителен на HBsAg, следует ввести иммуноглобулин против гепатита B (HBIG), в идеале в течение 48 часов после воздействия. ^{Footnote 18}.

В США лицензированы семь препаратов для лечения инфекции HBV: интерферон-α, пегилированный интерферон α-2a, ламивудин, адефовир, энтекавир, телбивудин и тенофовир. ^{Footnote 3}.

ИММУНИЗАЦИЯ : Два типа вакцины против HB были лицензированы и показали свою высокую эффективность против всех подтипов HBV. ^{Footnote 4, Footnote 11}. Первый, приготовленный из плазмы HBsAg-позитивных людей, все еще широко используется. Второй синтезирован с использованием рекомбинантной ДНК ^{Footnote 4}.Вакцинация против ВГВ должна стать нормой для лабораторного персонала. ^{Footnote 10}.

PROPHYLAXIS : Взрослые, ранее не иммунизированные, подвергшиеся воздействию HBsAg-положительной крови, должны как можно скорее получить HBIG, а также иммунизацию вакциной против HB, если не может быть подтвержден естественный иммунитет. ^{Footnote 4, Footnote 10}.

РАЗДЕЛ VI — ЛАБОРАТОРНЫЕ ОПАСНОСТИ

ИНФЕКЦИИ, ПРИОБРЕТЕННЫЕ В ЛАБОРАТОРИИ : Сообщается, что уровень инфицирования HBV в несколько раз выше среди сотрудников лабораторий, чем среди населения в целом, и это одна из наиболее часто регистрируемых инфекций, приобретенных в лаборатории. ^{Footnote 10}.

ИСТОЧНИКИ / ОБРАЗЦЫ : Кровь ^{Footnote 1-Footnote 12}, спинномозговая жидкость, слюна, сперма, синовиальная жидкость ^{Footnote 4, Footnote 12}, грудное молоко, желчь, фекалии, носоглоточные смывы, пот ^{Footnote 12}, , плевральные, перикардиальные, амниотические и незакрепленные ткани и органы ^{Footnote 4}.

ОСНОВНЫЕ ОПАСНОСТИ : Чрескожное (например, укол иглой) или контакт слизистой оболочки с кровью, которая может содержать HBsAg ^{Сноска 4}.

ОСОБЫЕ ОПАСНОСТИ : Существует вероятность заражения через аэрозоли и поверхности, зараженные HBV. ^{Footnote 10}.

РАЗДЕЛ VII — КОНТРОЛЬ ВОЗДЕЙСТВИЯ / ЛИЧНАЯ ЗАЩИТА

КЛАССИФИКАЦИЯ ГРУПП РИСКА : Группа риска 2 ^{Сноска 19}.

ТРЕБОВАНИЯ К СРЕДЕ : Помещения, оборудование и операционные методы Уровня 2 для работы с инфекционными или потенциально инфекционными материалами, животными или культурами.

ЗАЩИТНАЯ ОДЕЖДА : Лабораторный халат. Перчатки при неизбежном прямом контакте кожи с инфицированными материалами или животными. Защитные очки должны использоваться там, где существует известный или потенциальный риск воздействия брызг. ^{Footnote 20}.

ДРУГИЕ МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ : Все процедуры, которые могут привести к образованию аэрозолей, или связаны с высокими концентрациями или большими объемами, должны проводиться в боксе биологической безопасности (BSC). Использование игл, шприцев и других острых предметов должно быть строго ограничено.Дополнительные меры предосторожности следует учитывать при работе с животными или крупномасштабной деятельности. ^{Footnote 20}.

РАЗДЕЛ VIII — ОБРАЩЕНИЕ И ХРАНЕНИЕ

РАЗЛИВЫ : Дайте аэрозолям осесть и, надев защитную одежду, аккуратно накройте разлив бумажными полотенцами и нанесите соответствующее дезинфицирующее средство, начиная с периметра и двигаясь к центру. Перед очисткой дайте достаточно времени для контакта. ^{Footnote 20}.

УТИЛИЗАЦИЯ : Обеззараживайте все отходы, которые содержат инфекционный организм или контактировали с ним, с помощью автоклава, химической дезинфекции, гамма-облучения или сжигания перед утилизацией. ^{Footnote 20}.

ХРАНЕНИЕ : Инфекционный агент должен храниться в герметичных контейнерах, имеющих соответствующую маркировку ^{Сноска 20}.

РАЗДЕЛ IX — НОРМАТИВНАЯ И ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ

НОРМАТИВНАЯ ИНФОРМАЦИЯ : Импорт, транспортировка и использование патогенных микроорганизмов в Канаде регулируется многими регулирующими органами, включая Агентство общественного здравоохранения Канады, Министерство здравоохранения Канады, Канадское агентство по инспекции пищевых продуктов, Министерство окружающей среды Канады и Министерство транспорта Канады.Пользователи несут ответственность за соблюдение всех соответствующих законов, постановлений, руководств и стандартов.

ОБНОВЛЕНО : декабрь 2011 г.

ПОДГОТОВЛЕНО : Управление по регулированию патогенов, Агентство общественного здравоохранения Канады.

Хотя информация, мнения и рекомендации, содержащиеся в этом Паспорте безопасности патогенов, собраны из источников, которые считаются надежными, мы не несем ответственности за точность, достаточность или надежность, а также за любые потери или травмы, возникшие в результате использования информации.Часто обнаруживаются новые опасности, и эта информация может быть не полностью актуальной.

Тест ОТ-ПЦР на COVID-19: как ввести в заблуждение все человечество и заставить его принять социальные ограничения

Автор: доктор Паскаль Сакре, GlobalResearch.ca,

Пора всем выйти из этого негативного транса, этой коллективной истерии, потому что голод, бедность, массовая безработица убьют, косят гораздо больше людей, чем SARS-CoV-2!

Введение: использование техники блокировки общества

Вся текущая пропаганда пандемии COVID-19 основана на предположении, которое считается очевидным, верным и больше не подвергается сомнению:

Положительный тест ОТ-ПЦР означает, что он болен COVID.Это предположение вводит в заблуждение .

Очень немногие люди, включая врачей, понимают, как работает ПЦР-тест.

ОТ-ПЦР означает действие R eal T ime- P olymerase C hain R .

По-французски это означает: Réaction de Polymérisation en Chaîne en Temps Réel.

В медицине мы используем этот инструмент в основном для диагностики вирусной инфекции.

Исходя из клинической ситуации с наличием или отсутствием у пациента определенных симптомов, мы рассматриваем различные диагнозы на основе тестов.

В случае определенных инфекций, особенно вирусных, мы используем метод RT-PCR для подтверждения диагностической гипотезы, выдвинутой клинической картиной.

Обычно мы не проводим ОТ-ПЦР у пациентов с перегревом, кашлем или воспалительным синдромом!

Это лабораторный метод молекулярной биологии амплификации генов, поскольку он ищет следы генов (ДНК или РНК) путем их амплификации.

Помимо медицины, другие области применения — это генетика, исследования, промышленность и судебная экспертиза.

Методика проводится в специализированной лаборатории , это невозможно сделать ни в одной лаборатории, даже в больнице. Это влечет за собой определенную стоимость, а иногда и задержку в несколько дней между взятием образца и результатом.

Сегодня, с момента появления нового заболевания под названием COVID-19 ( CO rona VI rus D isease-20 19 ), диагностический метод RT-PCR используется для выявления положительных случаев, подтвержденных как SARS-CoV-2 (коронавирус, ответственный за новый острый респираторный дистресс-синдром, названный COVID-19).

Эти положительные случаи приравниваются к случаям COVID-19, , некоторые из которых госпитализированы или даже помещены в отделения интенсивной терапии.

Официальный постулат наших менеджеров: положительные случаи ОТ-ПЦР = пациенты с COVID-19.

Это исходный постулат, предпосылка всей официальной пропаганды, которая оправдывает все ограничительные меры правительства: изоляция, заключение, карантин, обязательные маски, цветовые коды по странам и запреты на поездки, отслеживание, социальные дистанции в компаниях, магазинах и даже что еще более важно, в школах.

Это неправильное использование техники ОТ-ПЦР используется как безжалостная и преднамеренная стратегия некоторых правительств , поддерживаемая советами по научной безопасности и доминирующими СМИ, для оправдания чрезмерных мер , таких как нарушение большого количества конституционных прав , разрушение экономики с банкротством целых активных слоев общества, ухудшение условий жизни большого количества простых граждан, под предлогом пандемии на основании ряда положительных тестов ОТ-ПЦР, а не на Реальное количество больных .

Технические аспекты: чтобы лучше понять и избежать манипуляций

Метод ПЦР был разработан химиком Кэри Б. Маллис в 1986 году. Кэри Маллис была удостоена Нобелевской премии по химии в 1993 году.

Хотя это оспаривается, говорят, что сам Кэри Маллис критиковал интерес к ПЦР как диагностическому инструменту для инфекции, особенно вирусной.

Он заявил, что если ПЦР — хороший инструмент для исследования, то в медицине, в клинике, это очень плохой инструмент.

Муллис имел в виду вирус СПИДа (ретровирус ВИЧ или ВИЧ) до пандемии COVID-19, но это мнение создателя об ограничении метода вирусных инфекций нельзя отвергать сразу; это надо учитывать!

ПЦР усовершенствован в 1992 году.

Поскольку анализ может выполняться в реальном времени, непрерывно, он становится RT (Real-Time) — PCR , даже более эффективным.

Это можно сделать из любой молекулы, включая молекулы живых, нуклеиновых кислот, составляющих гены:

Вирусы не считаются «живыми» существами, это пакеты информации (ДНК или РНК), образующие геном.

Искомая молекула выделяется с помощью техники амплификации (умножения), и этот момент очень важен.

ОТ-ПЦР — это метод амплификации.

Если в образце есть ДНК или РНК желаемого элемента, его нельзя идентифицировать как таковой.

Эта ДНК или РНК должна быть амплифицирована (умножена) определенное количество раз , иногда очень большое количество раз, прежде чем ее можно будет обнаружить.Из мельчайшего следа можно получить до миллиардов копий конкретного образца, но это не означает, что в исследуемом организме есть все это количество.

В случае COVID-19 элементом, который ищет ОТ-ПЦР, является SARS-CoV-2, РНК-вирус.

Существует ДНК-вирусов, таких как вирусы герпеса и ветряной оспы.

Самыми известными вирусами РНК , помимо коронавирусов, являются вирусы гриппа, кори, EBOLA, ZIKA.

В случае SARS-CoV-2, РНК-вируса, требуется дополнительный специфический этап — транскрипция РНК в ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы.

Этот шаг предшествует фазе усиления.

Идентифицируется не весь вирус , а последовательности его вирусного генома.

Это не означает, что последовательность данного гена, фрагмента вируса, не специфична для разыскиваемого вируса, но, тем не менее, это важный нюанс:

ОТ-ПЦР не выявляет никаких вирусов, а только части, специфичные последовательности гена вируса.

В начале года был секвенирован геном SARS-CoV-2.

Он состоит из примерно 30 000 пар оснований. Нуклеиновая кислота (ДНК-РНК), компонент генов, представляет собой последовательность оснований. Для сравнения: геном человека насчитывает более 3 миллиардов пар оснований.

Команды

непрерывно отслеживают эволюцию вирусного генома SARS-CoV-2 по мере его развития, через мутации, которым он подвергается. Сегодня существует множество вариантов.

Взяв несколько конкретных генов из генома SARS-CoV-2, можно инициировать ОТ-ПЦР на образце из дыхательных путей.

При заболевании COVID-19, имеющем точки входа в носоглотку (нос) и ротоглотку (рот), образец следует брать из верхних дыхательных путей как можно глубже, чтобы избежать заражения, в частности, слюной.

Все опрошенные сказали, что это очень больно.

Золотой стандарт (предпочтительное место для отбора проб) — это назофарингеальный (назальный) доступ , наиболее болезненный путь.

Если есть противопоказания к назальному доступу или, предпочтительно, к человеку, проходящему тестирование, в зависимости от официальных органов, ротоглоточный доступ (через рот) также допустим.Тест может вызвать тошноту / рвотный рефлекс у испытуемого.

Обычно для того, чтобы результат теста RT-PCR считался надежным, требуется амплификация из 3 различных генов (праймеров) исследуемого вируса .

«Праймеры представляют собой одноцепочечные последовательности ДНК, специфичные для вируса. Они гарантируют специфичность реакции амплификации. »
«Первый тест, разработанный доктором Ла Шарите в Берлине.Виктор Корман и его сотрудники в январе 2020 года позволили выделить последовательности РНК , присутствующие в 3 генах вируса под названием E, RdRp и N . Чтобы узнать, присутствуют ли последовательности этих генов в собранных образцах РНК, необходимо амплифицировать последовательности этих 3 генов, чтобы получить сигнал, достаточный для их обнаружения и количественной оценки. ».

Существенное понятие времени цикла или порога цикла или порога положительности Ct [16].

Тест ОТ-ПЦР отрицательный (нет следов желаемого элемента) или положительный (наличие следов желаемого элемента).

Однако, даже если желаемый элемент присутствует в течение минутного, ничтожно малого количества, принцип ОТ-ПЦР состоит в том, чтобы иметь возможность окончательно выделить его, продолжая циклы амплификации столько, сколько необходимо.