Фунгицидным действием обладает: значение и обзор лучшие препаратов

Содержание

значение и обзор лучшие препаратов

Любой садовод знает, что растения могут болеть. От этого страдает урожай. Наиболее распространенными и опасными являются грибковые заболевания. Они поражают растение очень быстро, оставляя микроспоры. Подавить рост грибков помогают вещества, называемые фунгицидами. Это химические препараты, предназначенные специально для борьбы с болезнетворными грибками. Применение фунгицидов в садоводстве имеет свои плюсы и минусы.

Содержание:

Механизм действия фунгицидов

Любые химические вещества, разработанные для борьбы с болезнями растений, вредителями, сорняками, называются пестицидами. Одной из разновидностей пестицидов являются фунгициды, которые имеют узкую направленность, они помогают избавиться от грибка. Действие препарата зависит от его разновидности. Одни фунгициды нацелены на профилактику, другие на лечение и уничтожение уже имеющегося грибка.

Фунгицидное действие – это воздействие препарата на споры грибка, которое тормозит его размножение и уничтожает клетки.

Лечить уже имеющийся грибок трудно, так как он быстро распространяется и поражает здоровые растения, поэтому большинство садоводов предпочитают использовать фунгициды в целях профилактики, чтобы предупредить возникновение болезней. Использовать фунгициды можно до появления каких-либо признаков грибкового заболевания или уже после. К таким признакам относят черные или белые пятна на листьях и стеблях, поражение плодов, следы гниения, опадание листьев.

Механизм действия фунгицидов разнообразен. Часто он включает в себя:

  1. Иммунизацию растений. Вещества проникают в клетки растения и провоцируют выработку собственных защитных веществ, которые помогают бороться с грибком.
  2. Образование некроза. На первый взгляд такое действие может показаться вредоносным. Но участки некроза на растении – это защита. Они не позволяют грибку проникать глубже в ткани растения.
  3. Подавление энергетического обмена. Препараты нарушают процесс энергетического обмена в клетках грибка, не позволяя ему развиваться и размножаться.
  4. Гиперпаразитизм. Некоторые вещества борются с грибками следующим образом: они проникают в структуру растения, выделяют токсичные вещества, которые подавляют развитие грибка, а затем питаются продуктами их разложения. Другими словами, препарат паразитирует на грибке.

Препараты могут быть комплексными, то есть сочетать различное воздействие на растение и грибок. Однако большинство фунгицидов действуют избирательно, то есть направлены на определенные виды грибка.

Классификация современных фунгицидов

Фунгициды разделяются на группы. Классификаций достаточно много. Выбор того или иного препарата зависит от вида растения и самого грибка, цели и особенностей применения препарата. Универсального фунгицида не существует. Для каждого случая нужно подбирать свой вариант.

Каждая разновидность фунгицида имеет свои достоинства и недостатки. Нужно помнить, что один и тот же препарат может по-разному действовать на различных культурах. Также действие разнится при использовании различных доз и сроков.

Существует несколько классификаций фунгицида:

  • По химическим свойствам. Фунгициды бывают органическими и неорганическими. В органических нет тяжелых металлов, они разлагаются естественным способом под действием бактерий. Неорганические фунгициды более стойкие и в некоторых случаях более эффективные, однако они требуют более осторожного использования и соблюдения точной дозировки.
  • По действию на возбудителя заболевания. Эта классификация включает я себя профилактические и лечебные фунгициды. Первые предупреждают появление заражения, повышают иммунитет растений, их защитные силы. Вторые направлены на уничтожение уже имеющегося грибка.
  • По цели применения. Цель у фунгицида может быть различная. Одни препараты предназначены для протравливания семян, другие – для обработки почвы, наземной части растений, плодов при хранении. Есть универсальные фунгициды, которые можно вносить почву и опрыскивать наземную часть растения одновременно.
  • По характеру распределения в тканях растения. Многие садоводы стремятся приобрести те препараты, которые не проникают внутрь растения, то есть являются контактными. Они находятся только на поверхности растения, вызывая гибель грибка. Однако эффективность таких фунгицидов зависит от многих факторов: дозировки, равномерности распределения, осадков и погодных условий. Системные фунгициды проникают в ткани растения, поэтому действуют быстрее и не реагируют на погодные условия.

Перед применением фунгицида нужно внимательно прочитать инструкцию. На препарате должно быть указано для какого растения и для борьбы с какими грибками он предназначен.

Преимущества и недостатки

Садоводы относятся к использованию фунгицидов по-разному. Одни стараются их избегать, так как считают, что они вредные для самих растений и плодов, а другие используют постоянно в целях профилактики, чтобы защитить свой урожай.

Однозначно можно сказать, что фунгициды оказывают определенное воздействие на растение. Вред от применения препаратов стараются минимизировать, но полностью исключить его трудно. Однако вред от фунгицидов не сравнится с вредным воздействием грибка, который способен полностью уничтожить урожай и остаться в почве.

Преимуществами фунгицидов являются:

  • Высокая эффективность. Фунгициды обычно имеют широкий спектр действия, то есть уничтожают большое количество штаммов грибов. Есть более направленные препараты против определенного грибка, их эффективность также высока, если правильно подобрать препарат.
  • Доступность. Фунгициды можно найти в любом садоводческом магазине. Цены на них разные, но можно легко найти препарат, который придется по карману.
  • Быстрый эффект. Неорганические фунгициды действуют максимально быстро, органические чуть медленнее. Но в любом случае эффекта долго ждать не придется. Это очень важно при грибковых заболеваниях, которые быстро распространяются и заражают здоровые растения.
  • Возможность использования на больших территориях. Фунгициды можно растворять в воде и обрабатывать большую территорию. Они позволяют обработать максимально большое количество культур за минимальный срок.

Вопрос вреда фунгицидов поднимается довольно часто. Конечно, любые препараты, воздействуя на возбудителя заболевания, затрагивают и сам организм. Фунгициды нельзя назвать абсолютно безвредными, однако здесь поднимается вопрос соотношения пользы и риска.

К недостаткам иногда относят факт, что после обработки какое-то время нельзя есть плоды, если процедура проводилась во время плодоношения. Поэтому рекомендуют не пренебрегать профилактикой. В этом случае понадобятся меньшие дозы препарата, и вред для самого растения и окружающей среды будет минимальным.

Обзор лучших фунгицидов

Приобрести фунгициды можно легко на рынке или в специализированном магазине, заказать по интернету. Однако эффективности можно ожидать только в том случае, если препарат не является подделкой. Поэтому покупать его лучше у проверенных производителей.

Выбор препаратов довольно велик, выбрать бывает непросто. В интернете можно найти отзывы покупателей. Однако стоит учитывать специфику того или иного препарата. Что подошло одному садоводу, может разочаровать другого.

Среди наиболее популярных фунгицидов называют:

  • Алирин Б. Это натуральный биофунгицид, в состав которого входит полезная почвенная микрофлора, позволяющая подавить размножение грибка. Препарат может использоваться против мучнистой росы, белой гнили, фитофтороза, ржавчинных и прочих грибков. Особенность этого фунгицида в том, что он не только может использоваться для почвы и наземной части растений, но и снижает уровень токсичности почвы после применения других химических веществ.
  • Бордоская смесь. Один из наиболее сильных препаратов для борьбы с грибковыми заболеваниями растений. В его состав входит сульфат меди. Препарат можно использовать практически для любых садовых растений. Однако для человека эта смесь опасна. Использовать ее нужно осторожно, соблюдая правила безопасности и используя защитную одежду. Медный купорос в составе быстро и эффективно уничтожает любой грибок.
  • Оксихом. Этот фунгицид считается контактно-системным. Его можно использовать и для профилактики, и для лечения грибковых заболеваний. Оксихом эффективен против мучнистой росы, макроспориоза, фитофтороза и других грибковых заболеваний. В состав препарата входят хлорокись меди и оксадиксил.
  • Топаз. Этот системный фунгицид стал популярен уже достаточно давно. Обычно его используют для лечения мучнистой росы и ржавчины. Этот препарат эффективен и не обладает высокой токсичностью. Он начинает действовать уже через несколько часов после использования.

Некоторые садоводы для увеличения эффективности препаратов параллельно используют народные средства. Однако в большинстве случаев фунгицида вполне достаточно.

Как использовать фунгициды и чем их заменить?

Фунгициды можно применять несколькими способами: вносить в почву, опрыскивать растения или протравливать семена. Чтобы эффективность была высокой, нужно соблюдать сроки и правила применения фунгицидов:

  1. Использовать фунгициды нужно только по мере необходимости. Даже если заражение не произошло и фунгициды нужны только для профилактики, есть определенные сроки, когда заражение может произойти. Бесконтрольное применение фунгицидов может навредить урожаю.
  2. Контактные фунгициды защищают только те части растения, на которые они попадают. Поэтому необходимо опрыскивать растения тщательно и со всем сторон, чтобы ничего не упустить. Желательно делать это в безветренную погоду, чтобы часть препарата не развеяло ветром. Дождь значительно снизит эффективность препаратов.
  3. Системные фунгициды эффективны сразу вне зависимости от осадков. Однако грибки быстро вырабатывают к ним иммунитет, поэтому желательно использовать эти препараты не чаще 2 раз в год.

Некоторые садоводы категорические не хотят использовать химикаты для защиты от грибков, поэтому ищут, чем же заменить фунгициды. К сожалению, грибковые заболевания растений встречаются довольно часто, и отказаться от использования фунгицидов совсем получается редко. Можно использовать народные рецепты. Так, например, для борьбы с грибком рекомендуют настой чеснока, марганцовку или раствор серы. Однако нужно помнить, что эффективность этих средств не всегда высокая.

Если растения уже поражены грибком, эксперименты могут привести к потере времени и урожая.

Тем садоводам, которые не хотят использовать токсичные фунгициды, можно порекомендовать органические их разновидности. К органическим фунгицидам относят Бактофит, Фитоспорин и т.д. Они содержат живые микроорганизмы, поэтому безопасны для людей, животных и даже насекомых.

Больше информации можно узнать из видео:

Arpimed

Как принимать Клотримазол

Рекомендуемая доза:

Крем Клотримазол вводят как можно глубже во влагалище один раз в день (предпочтительно перед сном) в течение 3 дней без перерыва. Достаточный курс лечения кремом 3 интравагинальные аппликации, согласно процедуре описанной ниже. Дополнительно может понадобиться применение крема для облегчения внешнего зуда и жжения, иногда связанного с вагинальной инфекцией, вызванной дрожжевыми грибками. Клотримазол предназначен только для вагинального применения и его никогда не следует принимать внутрь. Не следует проводить лечебный курс во время менструального цикла. Лечение должно быть закончено до начала менструации. Хотя возможно, что во время лечения Клотримазолом могут быть половые отношения, но предпочтительно, чтобы пары ждали окончания лечебного курса, чтобы предотвратить заражение Вашего партнера.

 

Наполнение аппликатора:

Снимите колпачок с тюбика Клотримазола, нажмите и проколите алюминиевую фольгу колпачком тюбика. Чтобы наполнить аппликатор, закрутите открытый конец цилиндра аппликатора на снабженное резьбой горлышко тюбика. Аккуратно начните выдавливать крем из тюбика. После этого движением поршня вверх втягивается необходимое количество крема в цилиндр аппликатора. По мере наполнения аппликатора поршень выводится наружу. Когда поршень доходит до упора и останавливается, надлежащее количество Клотримазола уже наполнено в аппликатор и аппликатор можно открутить с кончика тюбика. Закройте колпачком  и оставьте тюбик для следующего применения.

Введение крема:                                   Клотримазол крем вводится во влагалище таким же образом, как и тампон, стоя, присев или лежа на спине, в удобном для Вас положении. Вводите наполненный аппликатор во влагалище. Глубина введения зависит от того, насколько комфортно Вы чувствуете себя при введении. Удерживайте цилиндр аппликатора устойчиво, вводите крем во влагалище аккуратно давя на поршень аппликатора до тех пор, пока он не остановится. Введите крем как можно глубоко во влагалище, что и обеспечит максимальный эффект препарата. Извлеките аппликатор.

При каждой процедуре используйте новый аппликатор.

                                                    

Наружное применение крема:

Небольшое количество Клотримазол крема можно наносить на наружное отверстие влагалища, чтобы способствовать дополнительному облегчению внешних симптомов. Выдавите небольшое количество крема на палец и мягко распределите по раздраженной области влагалища. Следует использовать крем один или два раза в день и только в период, когда присутствуют внешние симптомы, не более чем 7 дней.

 

Если Вы применили больше Клотримазола, чем рекомендовано

Если Вы применили больше Клотримазола, чем рекомендовано, немедленно обратитесь к врачу, свяжитесь с сотрудниками скорой и неотложной помощи ближайшей больницы, даже если нет симптомов.

 

Возможные побочные эффекты

Если во время использования препарата у Вас возникла сыпь или новое раздражение, прекратите применение препарата и обратитесь к Вашему лечащему врачу.

Это не полный список побочных эффектов. При развитии непредвиденных побочных эффектов при использовании Клотримазола, обратитесь к врачу или фармацевту.

 

Отчетность о побочных эффектах:

Если Вы отметили какие-либо побочные эффекты, сообщите об этом своему лечащему врачу, фармацевту или медсестре. Это включает любые возможные побочные эффекты не перечисленные в этом листке-вкладыше. Также Вы можете сообщить о побочных эффектах компании ООО «Арпимед», перейдя на сайт www.arpimed.com и заполнить соответствующую форму «Сообщить о побочном действии или неэффективности лекарства» и в Научный центр экспертизы лекарств и медицинских технологий им. академика Э.Габриеляна, перейдя на сайт www.pharm.am в раздел “Сообщить о побочном эффекте лекарства” и заполнить форму “Карта сообщений о побочном действии лекарства”. Телефон горячей линии научного центра: +37410237665; +37498773368

 

Как хранить Клотримазол

Хранить при комнатной температуре, в сухом и недоступном для детей месте.

Срок годности – 3 года.

 

Содержимое упаковки и дополнительная информация

Что содержит Клотримазол

Каждый грамм Клотримазол 2% крема вагинального содержит:

активное вещество: клотримазол – 20 мг;

другие компоненты: цетеарет-12, цетеарет-20, парафин жидкий, цетостеариловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен,  пропиленгликоль, диметикон, вода очищенная.

 

Как выглядит Клотримазол и содержимое упаковки

Однородный крем ровного белого цвета, без запаха.

 

Описание упаковки

50 г крема вагинального в тубе алюминиевой вместе с 3 вагинальными аппликаторами и листком-вкладышем в пачке из картона. Вместимость одного аппликатора составляет 6 г                      Клотримазол 2% крема вагинального.

 

Условия отпуска

Отпускается по рецепту.

 

Бригада Центра дезинфекции проводит обработку подъездов домов под управлением ООО «ДГХ»

22 дек. 2020 г., 19:00

 

Препарат  «Жавельон» плюс вода — вот средство, которое используют сегодня для обработки входных групп и лестничных клеток в коломенских домах. Основной компонент — натриевая соль дихлоризоциануровой кислоты. Главное, что стоит запомнить, — раствор  обладает бактерицидным, фунгицидным действием. 

Именно он находится в пульверизаторах двух сотрудниц Центра дезинфекции, которые приехали на обработку домов №№ 7 и 9 по улице Гаврилова. Экипировка женщин — по всем правилам: защитный комбинезон, перчатки, респиратор. 

— Я и моя коллега работаем в паре, обычно одна начинает обработку этажей снизу вверх, а вторая спускается с верхнего этажа вниз, — говорит сотрудница Центра дезинфекции Ирина. — На один подъезд в девятиэтажном доме уходит около 20 минут. На дезинфекцию тратим 10 литров раствора  — это два пятилитровых пульверизатора. 

Спецраствор наносят на входные двери, ручки, кнопки лифтов, перила, почтовые ящики, крышки мусоропроводов — на все поверхности, которых обычно касаются руками жители.

— За день наша бригада обрабатывает примерно семь адресов, по одному-два подъезда в доме, — говорит Ирина. — Списки мест, которые необходимо дезинфицировать, нам выдаёт Департамент городского хозяйства. Адреса каждый раз разные. 

Следующий подъезд — новая порция «Жавельона». Определённый запас воды дезинфекторы возят с собой, но иногда приходится за ней обращаться к жителям. 

— Люди не очень охотно соглашаются налить воды, хотя мы просим всего 10 литров, — говорит Ирина. — Но мы понимаем: у кого-то счётчики на воду стоят, а кто-то просто не хочет контактировать с нами. Даже в подъезд иногда пускают не с первого раза. 

По заявкам Департамента городского хозяйства в Коломне работают несколько  бригад Центра дезинфекции.

Источник: http://in-kolomna.ru/novosti/zhkh/brigada-centra-dezinfekcii-provodit-obrabotku-podezdov-domov-pod-upravleniem-ooo-dgh

Диетолог рассказала, что произойдет с организмом, если часто есть чеснок

https://rsport. ria.ru/20200615/1572946921.html

Диетолог рассказала, что произойдет с организмом, если часто есть чеснок

Диетолог рассказала, что произойдет с организмом, если часто есть чеснок — РИА Новости Спорт, 15.06.2020

Диетолог рассказала, что произойдет с организмом, если часто есть чеснок

Употребление чеснока в умеренном количестве оказывает положительное влияние на сердечно-сосудистую систему, нормализует работу желудочно-кишечного тракта и… РИА Новости Спорт, 15.06.2020

2020-06-15T14:05

2020-06-15T14:05

2020-06-15T14:05

зож

питание

здоровье

чеснок

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdn25.img.ria.ru/images/07e4/03/14/1568911852_0:198:2936:1850_1920x0_80_0_0_a6a7f8ba0e23ac3709d558b532b44c9b.jpg

МОСКВА, 15 июн — РИА Новости. Употребление чеснока в умеренном количестве оказывает положительное влияние на сердечно-сосудистую систему, нормализует работу желудочно-кишечного тракта и укрепляет иммунитет, заявила врач-диетолог Светлана Фус. Она отмечает, что в чесноке содержится много полезных компонентов. Один из них — аллицин, серосодержащее органическое соединение, которое выделяется при механическом разрушении клеток чеснока и обладает бактерицидным и фунгицидным (противогрибковым) действием.Однако в сыром виде чеснок может терять большую часть полезных веществ «при взаимодействии с кислородом», утверждает Светлана Фус. Чтобы их сохранить, рекомендуется давить или резать чеснок непосредственно перед употреблением блюда.Для улучшения работы кишечника и сердечно-сосудистой системы необходимо съедать до 15 граммов чеснока в день. Однако увлекаться этим полезным продуктом можно не всем.

https://rsport.ria.ru/20200615/1572931678.html

РИА Новости Спорт

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2020

РИА Новости Спорт

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og. xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://rsport.ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости Спорт

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

https://cdn25.img.ria.ru/images/07e4/03/14/1568911852_103:0:2834:2048_1920x0_80_0_0_7c3b4d667b806f1678bdca60aa3e03b0.jpg

РИА Новости Спорт

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости Спорт

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

питание, здоровье, чеснок

МОСКВА, 15 июн — РИА Новости. Употребление чеснока в умеренном количестве оказывает положительное влияние на сердечно-сосудистую систему, нормализует работу желудочно-кишечного тракта и укрепляет иммунитет, заявила врач-диетолог Светлана Фус.

Она отмечает, что в чесноке содержится много полезных компонентов. Один из них — аллицин, серосодержащее органическое соединение, которое выделяется при механическом разрушении клеток чеснока и обладает бактерицидным и фунгицидным (противогрибковым) действием.

«Сырой и приготовленный чеснок имеют разную пользу. Тепловая обработка уменьшает его полезные свойства. Здесь все решает время: чем дольше чеснок подвергался воздействию тепла, тем больше активных веществ разрушается. Поэтому полезен свежий чеснок, аллицин содержится только в нем», — пишет в своем Instagram диетолог.

15 июня 2020, 10:45ЗОЖВредна ли еда, разогретая в микроволновке? Мнение врача-диетолога

Однако в сыром виде чеснок может терять большую часть полезных веществ «при взаимодействии с кислородом», утверждает Светлана Фус. Чтобы их сохранить, рекомендуется давить или резать чеснок непосредственно перед употреблением блюда.

Для улучшения работы кишечника и сердечно-сосудистой системы необходимо съедать до 15 граммов чеснока в день. Однако увлекаться этим полезным продуктом можно не всем.

«Эфирные масла и аллицин чеснока раздражают слизистые оболочки ЖКТ, желче- и мочевыводящих путей, — объясняет диетолог. — Если есть чеснок в большом количестве, то можно вызвать обострение хронических заболеваний этих органов. Кроме того, его не все любят из-за резкого запаха».

Сравнение действия фунгицидных и фунгистатических противогрибковых средств на морфогенетическую трансформацию Candida albicans | Журнал антимикробной химиотерапии

Аннотация

Сравнивали одиннадцать различных противогрибковых агентов, и их способность ингибировать морфогенетические

трансформация Candida albicans была исследована вместе с их способностью ингибировать

рост, измеренный по методологии MIC. Фунгицидный потенциал каждого агента также был

определенный.Из протестированных противогрибковых средств только амфотерицин B, мулундокандин и акулеацин.

подавлял трансформацию при значениях субмикк; все три агента проявили фунгицидную активность при

концентрации близкие к МПК. Все остальные агенты были фунгицидными только в концентрациях, значительно превышающих

выше МПК и ингибирует морфогенетическую трансформацию только при концентрациях

над микрофоном. Эти данные предполагают, что фунгицидные противогрибковые агенты с большей вероятностью действуют через

ингибирует морфогенетическую трансформацию C.albicans , в то время как фунгистатические агенты являются

не могут этого сделать и с большей вероятностью блокируют рост бутонами.

Введение

Candida albicans, диморфный гриб, вызывающий различные поверхностные и

глубоко укоренившиеся микозы, существуют в двух легко идентифицируемых морфологиях, а именно дрожжевых и гифах.

формы. 1 Есть некоторые свидетельства того, что гифальная форма

могут играть важную роль в патогенезе C. albicans, особенно в отношении

к способности организма проникать в клетки и ткани хозяина. 1 Точно так же гифальную форму часто считали

важна способность гриба прилипать к поверхности клеток. 1 Недавнее исследование показывает, что мутанты без гиф

avirulent, в отличие от вирулентного родительского штамма, предполагая, что способность образовывать гифы

могут играть важную роль в патогенезе C.albicans. 2

Принимая во внимание потенциальную роль этого диморфизма, понимание действия противогрибковых

агенты двух форм могут помочь в разработке лучших противогрибковых агентов. MIC

методологии, в том числе стандартизированные NCCLS, в значительной степени помогли

оценка противогрибковых средств против различных видов дрожжей. 3 Такая методика учитывает только ингибирование

роста клеток и не позволяет оценить влияние лекарств на трансформацию

от дрожжевой формы к гифальной форме.Недавно мы описали модифицированную версию NCCLS.

процедура, которая может быть использована для изучения влияния противогрибковых средств на морфогенетические

трансформация дрожжевых форм в гифы. 4

В этом исследовании мы использовали различные клинические и лабораторные штаммы для изучения эффектов широкого спектра

ряд противогрибковых препаратов на морфогенетическую трансформацию C. albicans. Наши

результаты показывают, что более фунгицидные противогрибковые агенты, например амфотерицин B и

эхинокандины, с гораздо большей вероятностью ингибируют трансформацию, чем менее фунгицидные

агенты, например азолы и флуцитозин.

Материалы и методы

Определение МИК и морфогенетической трансформации

Синхронизированная фаза дрожжей Клетки C. albicans использовали во всех экспериментах и ​​были

подготовлен, как описано ранее. 4 C. albicans эталонных штаммов ATCC

и

3 и клинические изоляты 200/175, 352, 94/03, 94/14 и 94/57

использовались повсюду. Синхронизированные со стационарной фазой дрожжевые клетки собирали с помощью

центрифугирование, промыли трижды в 0.1 M фосфатно-солевой буфер и сразу же использовать в

стандартные анализы MIC 3 и эксперименты по морфогенетической трансформации. 4 Влияние различных противогрибковых средств на

морфогенетическую трансформацию C. albicans оценивали путем исследования содержимого

96-луночных микротитровальных планшетов после 3 ч инкубации при 35 ° C с использованием фазово-контрастной микроскопии

(с использованием микроскопа Olympus CK и фазово-контрастного микроскопа Zeiss), как описано

ранее. 4

Минимальная фунгицидная концентрация

образцов (10 мкл) были удалены из всех лунок стандартных планшетов MIC и нанесены на них.

в прямоугольные чашки, содержащие агар с декстрозой Сабуро. Чашки инкубировали в течение

24–48

ч при 35 ° C. Минимальная фунгицидная концентрация (MFC) определялась как концентрация

противогрибковый агент, у которого количество колониеобразующих единиц было равно нулю.

Противогрибковые средства и химикаты

Итраконазол, кетоконазол и миконазол были приобретены у Janssen Pharmaceutica, Beerse,

Belguim.Флуконазол очищали (чистота 95%) из капсул Дифлюкана (Pfizer Central

Research, Sandwich, Великобритания). Амфотерицин B, туникамицин и флуцитозин были приобретены в

Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США). Тербинафин и аморолфин были от Сандоз,

Вена, Австрия. Мулундокандин и акулеацин были синтезированы в Hoechst AG, Франкфурт,

Германия. MOPS и диметилсульфоксид (ДМСО) были от Sigma. Противогрибковые агенты были

растворенный в ДМСО, за исключением туникамицина и флуцитозина, которые были растворены в

стерильная дистиллированная вода.ДМСО (конечная концентрация <2% об. / Об.) Не влиял на МИК или морфогенетическая трансформация.

Результаты и обсуждение

Определения MIC и MFC

Ингибирование роста различными противогрибковыми агентами и МФЦ этих агентов для

Было исследовано несколько клинических изолятов и лабораторных штаммов C. albicans, . Все штаммы

были высокочувствительны к амфотерицину B (МИК 0.06-0,12 мг / л), туникамицин (МИК

0,12-0,25

мг / л) и акулеацина (МПК 0,25-0,5 мг / л), но менее чувствительны к мулундокандину (таблица). Амфотерицин B, мулундокандин и акулеацин обычно были

фунгицидный при

концентрации, близкие к МИК (2-4 × МИК), в то время как туникамицин показал более

умеренная фунгицидная способность, поскольку она была фунгицидной при 8-16 × MIC (таблица). Из испытанных азольных противогрибковых средств итраконазол и кетоконазол показали:

хороший

активность против всех C.albicans (таблица), а

флуконазол и миконазол показали хорошую активность против четырех из этих штаммов C. albicans (ATCC

, ATCC , 352 и 200/175) с диапазонами MIC 0,25-0,5.

мг / л и

0,06-0,25 мг / л соответственно. Однако при тестировании против штаммов 94/03, 94/14 и

94/57,

флуконазол и миконазол были значительно менее активны с диапазоном МИК 8 мг / л и

8–16

мг / л соответственно. Флуцитозин проявлял хорошую активность против шести штаммов и был неактивным.

против C. albicans ATCC , как описано ранее. 3 Напротив, тербинафин и аморолфин показали умеренную

активность против семи штаммов с диапазонами MIC 2-8 мг / л и 2-4 мг / л,

соответственно

(Таблица). Азолы и другие агенты проявляли фунгицидную способность только при

высокие концентрации (32-128 × МИК).

Влияние противогрибковых препаратов на морфогенетическую трансформацию

Влияние противогрибковых препаратов на морфогенетическую трансформацию различных C.albicans . Фунгицидные средства амфотерицин В, мулундокандин.

и акулеацин все блокировали морфогенетическую трансформацию при концентрациях ниже их

соответствующие значения МИК (таблица). Туникамицин также подавлял

морфогенетическая трансформация, но в концентрациях выше МИК (морфогенетическая

трансформация 0,25-0,5 мг / л; МПК 0,12-0,25 мг / л). Флуконазол и

миконазол имел

низкие МИК против четырех чувствительных к азолам штаммов и повлияли на морфогенетические

трансформация только при более высоких концентрациях (таблица).Влияние на

морфогенетическая трансформация наблюдалась при еще более высоких концентрациях на трех штаммах

с пониженной чувствительностью к азольным агентам (данные не представлены). Аналогично итраконазол и

кетоконазол, который был активен против всех штаммов по определению МИК, влиял только на

морфогенетическая трансформация при высоких концентрациях (таблица). Из

оставаясь противогрибковыми агентами, флуцитозин был слабым ингибитором морфогенетических

трансформация, несмотря на его хорошую активность против шести штаммов, измеренную с помощью MIC.Тербинафин и аморолфин проявляли некоторую активность по оценке МПК, но мало влияли на

морфогенетическая трансформация (таблица).

Сравнение MIC, морфогенетической трансформации и MFC

Чтобы лучше описать различия, соотношение морфогенетической трансформации / МИК было

рассчитано для каждого противогрибкового средства (таблица). Эти соотношения можно использовать для

определить относительную эффективность каждого агента по подавлению роста и трансформации: (i) соотношение <1 (агенты, которые преимущественно ингибируют морфогенетическую трансформацию): амфотерицин B, мулундокандин и акулеацин; (ii) соотношение 1-2 (с примерно равным влиянием на эти два процесса): туникамицин; и (iii) соотношение> 2 (агенты с более низкой способностью ингибировать

формы гиф и проявляют свою активность, подавляя дрожжевую форму): азолы, тербинафин,

флуцитозин и аморолфин.Также было рассчитано соотношение MFC / MIC (таблица). Данные свидетельствуют о том, что агенты с высоким фунгицидным потенциалом, например

амфотерицин B также обладает высоким потенциалом блокирования морфогенетической трансформации. Агенты с

низкий фунгицидный потенциал, например флуконазол, значительно менее способны ингибировать

морфогенетическая трансформация.

Комплекс изучения действия противогрибковых средств на морфогенетическую трансформацию

и MIC предоставляет дополнительную информацию о действии противогрибковых агентов против обоих

дрожжевые и гифальные формы C. albicans и может быть связано с их фунгицидным действием.

потенциал. Наши данные предполагают, что фунгицидные агенты действуют как против морфогенетической трансформации, так и против морфогенетической трансформации.

и процесс бутонизации. Фунгицидные агенты, амфотерицин B, мулундокандин и акулеацин,

нарушает мембрану 5 или целостность клеточной стенки, 6 и, следовательно, подавляет форму гиф на низком уровне

концентрации. Менее фунгицидные агенты (азолы, тербинафин и флуцитозин), проявляющие их

противогрибковое действие за счет ингибирования деметилазы цитохрома P450, скваленэпоксидазы 7 , 8 и синтеза РНК и ДНК, 5 соответственно, как правило, менее эффективны против

морфогенетическая трансформация, предполагающая, что они преимущественно ингибируют процесс почкования.Это

Соблазнительно предположить, что способность амфотерицина B и эхинокандинов уменьшать грибковые

эффективная загрузка in vivo, по сравнению с азолами, частично может быть связано с их

способность влиять на морфогенетическую трансформацию.

В заключение, анализы морфогенетической трансформации и МИК, использованные в этом исследовании, объединили

с расчетом соотношения морфогенетическая трансформация / МИК, может помочь в предварительном

скрининг новых противогрибковых агентов.Действительно, некоторые виды противогрибковых средств ранее применялись.

с помощью методологии MIC продемонстрировали незначительную активность или ее отсутствие, хотя

эффективность in vivo — эхинокандины обычно проявляют слабую активность или не проявляют активности против Aspergillus spp. по оценке MIC, но эффективны in vivo и известны

уменьшить образование гиф. 6 Анализ морфогенетической трансформации очень

помогают в характеристике активности новых противогрибковых агентов и могут различать

фунгицидное из фунгистатических соединений.Анализ выполняется быстро: данные генерируются в течение 3 часов, так как

по сравнению с 48 часами для стандартных процедур MIC.

Таблица.

Сравнение МИК, морфогенетической трансформации и минимального фунгицидного действия

трансформация (MFC) противогрибковых агентов против C. albicans a

9015 9015 9015 9015 9015 902

6 9015 9015 9015 9015 9015 9015

Противогрибковое средство
.
MIC
.
MT
.
MFC
.
MT / MIC
.
MFC / MIC
.
a Значения MIC, морфогенетической трансформации (MT) и MFC равны

выражается в виде средних значений (мг / л) для каждого противогрибкового агента.

b Медиана рассчитывалась только на основе чувствительных штаммов

по оценке ВПК; люди с пониженной восприимчивостью или устойчивостью к лекарствам были исключены (см.

текст).

Амфотерицин B 0,06 0,02 0,25 0,33 4
Акулеацин 0,25 9015 9015 902 902 1 0,012 4 0,012 4
Туникамицин 0,25 0,5 8 2 32
32
5 8 32 16 64
Итраконазол 0,5 8 32 16 64
64
Миконазол b 0,25 16 32 64 128
Флюцитозин

65 9015 b 9005

64 128 128 > 128
Тербинафин 8 32 128 4 16
9015 9015 9015 9015

9015 9015 9015 8 16

9015 9015 9015 9015 9015 902

6 9015 9015 9015 9015 9015 9015

Противогрибковое средство
.
MIC
.
MT
.
MFC
.
MT / MIC
.
MFC / MIC
.
a Значения MIC, морфогенетической трансформации (MT) и MFC равны

выражается в виде средних значений (мг / л) для каждого противогрибкового агента.

b Медиана рассчитывалась только на основе чувствительных штаммов

по оценке ВПК; люди с пониженной восприимчивостью или устойчивостью к лекарствам были исключены (см.

текст).

Амфотерицин B 0,06 0,02 0,25 0,33 4
Акулеацин 0,25 9015 9015 902 902 1 0,012 4 0,012 4
Туникамицин 0,25 0,5 8 2 32
32
5 8 32 16 64
Итраконазол 0,5 8 32 16 64
64
Миконазол b 0,25 16 32 64 128
Флюцитозин

65 9015 b 9005

64 128 128 > 128
Тербинафин 8 32 128 4 16
9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 8 16

Таблица.

Сравнение МИК, морфогенетической трансформации и минимального фунгицидного действия

трансформация (MFC) для противогрибковых средств против C.albicans a

9015 9015 9015 9015 9015 902

6 9015 9015 9015 9015 9015 9015

Противогрибковое средство
.
MIC
.
MT
.
MFC
.
MT / MIC
.
MFC / MIC
.
a Значения MIC, морфогенетической трансформации (MT) и MFC равны

выражается в виде средних значений (мг / л) для каждого противогрибкового агента.

b Медиана рассчитывалась только на основе чувствительных штаммов

по оценке ВПК; люди с пониженной восприимчивостью или устойчивостью к лекарствам были исключены (см.

текст).

Амфотерицин B 0,06 0,02 0,25 0,33 4
Акулеацин 0,25 9015 9015 902 902 1 0,012 4 0,012 4
Туникамицин 0,25 0,5 8 2 32
32
5 8 32 16 64
Итраконазол 0,5 8 32 16 64
64
Миконазол b 0,25 16 32 64 128
Флюцитозин

65 9015 b 9005

64 128 128 > 128
Тербинафин 8 32 128 4 16
9015 9015 9015 9015

9015 9015 9015 8 16

9015 9015 9015 9015 9015 902

6 9015 9015 9015 9015 9015 9015

Противогрибковое средство
.
MIC
.
MT
.
MFC
.
MT / MIC
.
MFC / MIC
.
a Значения MIC, морфогенетической трансформации (MT) и MFC равны

выражается в виде средних значений (мг / л) для каждого противогрибкового агента.

b Медиана рассчитывалась только на основе чувствительных штаммов

по оценке ВПК; люди с пониженной восприимчивостью или устойчивостью к лекарствам были исключены (см.

текст).

Амфотерицин B 0,06 0,02 0,25 0,33 4
Акулеацин 0,25 9015 9015 902 902 1 0,012 4 0,012 4
Туникамицин 0,25 0,5 8 2 32
32
5 8 32 16 64
Итраконазол 0,5 8 32 16 64
64
Миконазол b 0,25 16 32 64 128
Флюцитозин

65 9015 b 9005

64 128 128 > 128
Тербинафин 8 32 128 4 16
9015 9015 9015 9015

9015 9015 9015 8 16

Ссылки

1.

Odds, F. C. (1988). Candida and Candidosis , 2-е изд. Баллиер Тиндалл, Лондон.

2.

Ло, Х. Дж., Колер, Дж. Р., Дидоменико, Б., Лёбенберг, Д., Каччапуоти, А. и Финк, Г. Р. (

1997

). Нефиламентные мутанты C. albicans являются авирулентными.

Ячейка

90

,

939


49. 3.

Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам. (1995). Эталонный метод для бульона

Разведение дрожжей на чувствительность к противогрибковым препаратам: предварительный стандарт M27-T. NCCLS,

Вилланова, П.А.

4.

Хосер, С., Франколини, М. и Ислам, К. (

1996

). Влияние противогрибковых средств на

морфогенетическая трансформация Candida albicans in vitro.

Журнал

Антимикробная химиотерапия

38

,

579

‐87. 5.

Керридж Д. (

1986

). Механизм действия клинически важных противогрибковых препаратов.

Достижения в физиологии микробов

27

,

1


72. 6.

Курц, М. Б., Хит, И. Б., Марринан, Дж., Дрейкхорн, С., Ониши, Дж. И Дуглас, К. (

1994

). Морфологические эффекты липопептидов против Aspergillus fumigatus коррелят

с активностью против (1,3) -β-d-глюкансинтазы.

Противомикробное средство

Агенты и химиотерапия

38

,

1480

-9. 7.

Vanden Bossche, H. (1988). Механизм действия пиридиновых, пиримидиновых и азольных противогрибковых средств.В Ингибиторы биосинтеза стеролов: фармацевтические и агрохимические аспекты (Berg, D. &

Plempel, M. Eds), стр. 79–119. VCH Publishers Inc., Нью-Йорк.

8.

Райдер, Н. С. (

1988

). Механизмы действия и биохимическая селективность

аллиламиновые антимикотические средства.

Анналы Нью-Йоркской академии наук

544

,

208

‐20.

Британское общество антимикробной химиотерапии

Сравнение действия фунгицидных и фунгистатических противогрибковых средств на морфогенетическую трансформацию Candida albicans | Журнал антимикробной химиотерапии

Аннотация

Сравнивали одиннадцать различных противогрибковых агентов, и их способность ингибировать морфогенетические

трансформация Candida albicans была исследована вместе с их способностью ингибировать

рост, измеренный по методологии MIC.Фунгицидный потенциал каждого агента также был

определенный. Из протестированных противогрибковых средств только амфотерицин B, мулундокандин и акулеацин.

подавлял трансформацию при значениях субмикк; все три агента проявили фунгицидную активность при

концентрации близкие к МПК. Все остальные агенты были фунгицидными только в концентрациях, значительно превышающих

выше МПК и ингибирует морфогенетическую трансформацию только при концентрациях

над микрофоном. Эти данные предполагают, что фунгицидные противогрибковые агенты с большей вероятностью действуют через

ингибирует морфогенетическую трансформацию C.albicans , в то время как фунгистатические агенты являются

не могут этого сделать и с большей вероятностью блокируют рост бутонами.

Введение

Candida albicans, диморфный гриб, вызывающий различные поверхностные и

глубоко укоренившиеся микозы, существуют в двух легко идентифицируемых морфологиях, а именно дрожжевых и гифах.

формы. 1 Есть некоторые свидетельства того, что гифальная форма

могут играть важную роль в патогенезе C.albicans, особенно в отношении

к способности организма проникать в клетки и ткани хозяина. 1 Точно так же гифальную форму часто считали

важна способность гриба прилипать к поверхности клеток. 1 Недавнее исследование показывает, что мутанты без гиф

avirulent, в отличие от вирулентного родительского штамма, предполагая, что способность образовывать гифы

могут играть важную роль в патогенезе C.albicans. 2

Принимая во внимание потенциальную роль этого диморфизма, понимание действия противогрибковых

агенты двух форм могут помочь в разработке лучших противогрибковых агентов. MIC

методологии, в том числе стандартизированные NCCLS, в значительной степени помогли

оценка противогрибковых средств против различных видов дрожжей. 3 Такая методика учитывает только ингибирование

роста клеток и не позволяет оценить влияние лекарств на трансформацию

от дрожжевой формы к гифальной форме.Недавно мы описали модифицированную версию NCCLS.

процедура, которая может быть использована для изучения влияния противогрибковых средств на морфогенетические

трансформация дрожжевых форм в гифы. 4

В этом исследовании мы использовали различные клинические и лабораторные штаммы для изучения эффектов широкого спектра

ряд противогрибковых препаратов на морфогенетическую трансформацию C. albicans. Наши

результаты показывают, что более фунгицидные противогрибковые агенты, например амфотерицин B и

эхинокандины, с гораздо большей вероятностью ингибируют трансформацию, чем менее фунгицидные

агенты, например азолы и флуцитозин.

Материалы и методы

Определение МИК и морфогенетической трансформации

Синхронизированная фаза дрожжей Клетки C. albicans использовали во всех экспериментах и ​​были

подготовлен, как описано ранее. 4 C. albicans эталонных штаммов ATCC

и

3 и клинические изоляты 200/175, 352, 94/03, 94/14 и 94/57

использовались повсюду. Синхронизированные со стационарной фазой дрожжевые клетки собирали с помощью

центрифугирование, промыли трижды в 0.1 M фосфатно-солевой буфер и сразу же использовать в

стандартные анализы MIC 3 и эксперименты по морфогенетической трансформации. 4 Влияние различных противогрибковых средств на

морфогенетическую трансформацию C. albicans оценивали путем исследования содержимого

96-луночных микротитровальных планшетов после 3 ч инкубации при 35 ° C с использованием фазово-контрастной микроскопии

(с использованием микроскопа Olympus CK и фазово-контрастного микроскопа Zeiss), как описано

ранее. 4

Минимальная фунгицидная концентрация

образцов (10 мкл) были удалены из всех лунок стандартных планшетов MIC и нанесены на них.

в прямоугольные чашки, содержащие агар с декстрозой Сабуро. Чашки инкубировали в течение

24–48

ч при 35 ° C. Минимальная фунгицидная концентрация (MFC) определялась как концентрация

противогрибковый агент, у которого количество колониеобразующих единиц было равно нулю.

Противогрибковые средства и химикаты

Итраконазол, кетоконазол и миконазол были приобретены у Janssen Pharmaceutica, Beerse,

Belguim.Флуконазол очищали (чистота 95%) из капсул Дифлюкана (Pfizer Central

Research, Sandwich, Великобритания). Амфотерицин B, туникамицин и флуцитозин были приобретены в

Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США). Тербинафин и аморолфин были от Сандоз,

Вена, Австрия. Мулундокандин и акулеацин были синтезированы в Hoechst AG, Франкфурт,

Германия. MOPS и диметилсульфоксид (ДМСО) были от Sigma. Противогрибковые агенты были

растворенный в ДМСО, за исключением туникамицина и флуцитозина, которые были растворены в

стерильная дистиллированная вода.ДМСО (конечная концентрация <2% об. / Об.) Не влиял на МИК или морфогенетическая трансформация.

Результаты и обсуждение

Определения MIC и MFC

Ингибирование роста различными противогрибковыми агентами и МФЦ этих агентов для

Было исследовано несколько клинических изолятов и лабораторных штаммов C. albicans, . Все штаммы

были высокочувствительны к амфотерицину B (МИК 0.06-0,12 мг / л), туникамицин (МИК

0,12-0,25

мг / л) и акулеацина (МПК 0,25-0,5 мг / л), но менее чувствительны к мулундокандину (таблица). Амфотерицин B, мулундокандин и акулеацин обычно были

фунгицидный при

концентрации, близкие к МИК (2-4 × МИК), в то время как туникамицин показал более

умеренная фунгицидная способность, поскольку она была фунгицидной при 8-16 × MIC (таблица). Из испытанных азольных противогрибковых средств итраконазол и кетоконазол показали:

хороший

активность против всех C.albicans (таблица), а

флуконазол и миконазол показали хорошую активность против четырех из этих штаммов C. albicans (ATCC

, ATCC , 352 и 200/175) с диапазонами MIC 0,25-0,5.

мг / л и

0,06-0,25 мг / л соответственно. Однако при тестировании против штаммов 94/03, 94/14 и

94/57,

флуконазол и миконазол были значительно менее активны с диапазоном МИК 8 мг / л и

8–16

мг / л соответственно.Флуцитозин проявлял хорошую активность против шести штаммов и был неактивным.

против C. albicans ATCC , как описано ранее. 3 Напротив, тербинафин и аморолфин показали умеренную

активность против семи штаммов с диапазонами MIC 2-8 мг / л и 2-4 мг / л,

соответственно

(Таблица). Азолы и другие агенты проявляли фунгицидную способность только при

высокие концентрации (32-128 × МИК).

Влияние противогрибковых препаратов на морфогенетическую трансформацию

Влияние противогрибковых препаратов на морфогенетическую трансформацию различных C.albicans . Фунгицидные средства амфотерицин В, мулундокандин.

и акулеацин все блокировали морфогенетическую трансформацию при концентрациях ниже их

соответствующие значения МИК (таблица). Туникамицин также подавлял

морфогенетическая трансформация, но в концентрациях выше МИК (морфогенетическая

трансформация 0,25-0,5 мг / л; МПК 0,12-0,25 мг / л). Флуконазол и

миконазол имел

низкие МИК против четырех чувствительных к азолам штаммов и повлияли на морфогенетические

трансформация только при более высоких концентрациях (таблица).Влияние на

морфогенетическая трансформация наблюдалась при еще более высоких концентрациях на трех штаммах

с пониженной чувствительностью к азольным агентам (данные не представлены). Аналогично итраконазол и

кетоконазол, который был активен против всех штаммов по определению МИК, влиял только на

морфогенетическая трансформация при высоких концентрациях (таблица). Из

оставаясь противогрибковыми агентами, флуцитозин был слабым ингибитором морфогенетических

трансформация, несмотря на его хорошую активность против шести штаммов, измеренную с помощью MIC.Тербинафин и аморолфин проявляли некоторую активность по оценке МПК, но мало влияли на

морфогенетическая трансформация (таблица).

Сравнение MIC, морфогенетической трансформации и MFC

Чтобы лучше описать различия, соотношение морфогенетической трансформации / МИК было

рассчитано для каждого противогрибкового средства (таблица). Эти соотношения можно использовать для

определить относительную эффективность каждого агента по подавлению роста и трансформации: (i) соотношение <1 (агенты, которые преимущественно ингибируют морфогенетическую трансформацию): амфотерицин B, мулундокандин и акулеацин; (ii) соотношение 1-2 (с примерно равным влиянием на эти два процесса): туникамицин; и (iii) соотношение> 2 (агенты с более низкой способностью ингибировать

формы гиф и проявляют свою активность, подавляя дрожжевую форму): азолы, тербинафин,

флуцитозин и аморолфин.Также было рассчитано соотношение MFC / MIC (таблица). Данные свидетельствуют о том, что агенты с высоким фунгицидным потенциалом, например

амфотерицин B также обладает высоким потенциалом блокирования морфогенетической трансформации. Агенты с

низкий фунгицидный потенциал, например флуконазол, значительно менее способны ингибировать

морфогенетическая трансформация.

Комплекс изучения действия противогрибковых средств на морфогенетическую трансформацию

и MIC предоставляет дополнительную информацию о действии противогрибковых агентов против обоих

дрожжевые и гифальные формы C.albicans и может быть связано с их фунгицидным действием.

потенциал. Наши данные предполагают, что фунгицидные агенты действуют как против морфогенетической трансформации, так и против морфогенетической трансформации.

и процесс бутонизации. Фунгицидные агенты, амфотерицин B, мулундокандин и акулеацин,

нарушает мембрану 5 или целостность клеточной стенки, 6 и, следовательно, подавляет форму гиф на низком уровне

концентрации. Менее фунгицидные агенты (азолы, тербинафин и флуцитозин), проявляющие их

противогрибковое действие за счет ингибирования деметилазы цитохрома P450, скваленэпоксидазы 7 , 8 и синтеза РНК и ДНК, 5 соответственно, как правило, менее эффективны против

морфогенетическая трансформация, предполагающая, что они преимущественно ингибируют процесс почкования.Это

Соблазнительно предположить, что способность амфотерицина B и эхинокандинов уменьшать грибковые

эффективная загрузка in vivo, по сравнению с азолами, частично может быть связано с их

способность влиять на морфогенетическую трансформацию.

В заключение, анализы морфогенетической трансформации и МИК, использованные в этом исследовании, объединили

с расчетом соотношения морфогенетическая трансформация / МИК, может помочь в предварительном

скрининг новых противогрибковых агентов.Действительно, некоторые виды противогрибковых средств ранее применялись.

с помощью методологии MIC продемонстрировали незначительную активность или ее отсутствие, хотя

эффективность in vivo — эхинокандины обычно проявляют слабую активность или не проявляют активности против Aspergillus spp. по оценке MIC, но эффективны in vivo и известны

уменьшить образование гиф. 6 Анализ морфогенетической трансформации очень

помогают в характеристике активности новых противогрибковых агентов и могут различать

фунгицидное из фунгистатических соединений.Анализ выполняется быстро: данные генерируются в течение 3 часов, так как

по сравнению с 48 часами для стандартных процедур MIC.

Таблица.

Сравнение МИК, морфогенетической трансформации и минимального фунгицидного действия

трансформация (MFC) противогрибковых агентов против C. albicans a

9015 9015 9015 9015 9015 902

6 9015 9015 9015 9015 9015 9015

Противогрибковое средство
.
MIC
.
MT
.
MFC
.
MT / MIC
.
MFC / MIC
.
a Значения MIC, морфогенетической трансформации (MT) и MFC равны

выражается в виде средних значений (мг / л) для каждого противогрибкового агента.

b Медиана рассчитывалась только на основе чувствительных штаммов

по оценке ВПК; люди с пониженной восприимчивостью или устойчивостью к лекарствам были исключены (см.

текст).

Амфотерицин B 0,06 0,02 0,25 0,33 4
Акулеацин 0,25 9015 9015 902 902 1 0,012 4 0,012 4
Туникамицин 0,25 0,5 8 2 32
32
5 8 32 16 64
Итраконазол 0,5 8 32 16 64
64
Миконазол b 0,25 16 32 64 128
Флюцитозин

65 9015 b 9005

64 128 128 > 128
Тербинафин 8 32 128 4 16
9015 9015 9015 9015

9015 9015 9015 8 16

9015 9015 9015 9015 9015 902

6 9015 9015 9015 9015 9015 9015

Противогрибковое средство
.
MIC
.
MT
.
MFC
.
MT / MIC
.
MFC / MIC
.
a Значения MIC, морфогенетической трансформации (MT) и MFC равны

выражается в виде средних значений (мг / л) для каждого противогрибкового агента.

b Медиана рассчитывалась только на основе чувствительных штаммов

по оценке ВПК; люди с пониженной восприимчивостью или устойчивостью к лекарствам были исключены (см.

текст).

Амфотерицин B 0,06 0,02 0,25 0,33 4
Акулеацин 0,25 9015 9015 902 902 1 0,012 4 0,012 4
Туникамицин 0,25 0,5 8 2 32
32
5 8 32 16 64
Итраконазол 0,5 8 32 16 64
64
Миконазол b 0,25 16 32 64 128
Флюцитозин

65 9015 b 9005

64 128 128 > 128
Тербинафин 8 32 128 4 16
9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 9015 8 16

Таблица.

Сравнение МИК, морфогенетической трансформации и минимального фунгицидного действия

трансформация (MFC) для противогрибковых средств против C.albicans a

9015 9015 9015 9015 9015 902

6 9015 9015 9015 9015 9015 9015

Противогрибковое средство
.
MIC
.
MT
.
MFC
.
MT / MIC
.
MFC / MIC
.
a Значения MIC, морфогенетической трансформации (MT) и MFC равны

выражается в виде средних значений (мг / л) для каждого противогрибкового агента.

b Медиана рассчитывалась только на основе чувствительных штаммов

по оценке ВПК; люди с пониженной восприимчивостью или устойчивостью к лекарствам были исключены (см.

текст).

Амфотерицин B 0,06 0,02 0,25 0,33 4
Акулеацин 0,25 9015 9015 902 902 1 0,012 4 0,012 4
Туникамицин 0,25 0,5 8 2 32
32
5 8 32 16 64
Итраконазол 0,5 8 32 16 64
64
Миконазол b 0,25 16 32 64 128
Флюцитозин

65 9015 b 9005

64 128 128 > 128
Тербинафин 8 32 128 4 16
9015 9015 9015 9015

9015 9015 9015 8 16

9015 9015 9015 9015 9015 902

6 9015 9015 9015 9015 9015 9015

Противогрибковое средство
.
MIC
.
MT
.
MFC
.
MT / MIC
.
MFC / MIC
.
a Значения MIC, морфогенетической трансформации (MT) и MFC равны

выражается в виде средних значений (мг / л) для каждого противогрибкового агента.

b Медиана рассчитывалась только на основе чувствительных штаммов

по оценке ВПК; люди с пониженной восприимчивостью или устойчивостью к лекарствам были исключены (см.

текст).

Амфотерицин B 0,06 0,02 0,25 0,33 4
Акулеацин 0,25 9015 9015 902 902 1 0,012 4 0,012 4
Туникамицин 0,25 0,5 8 2 32
32
5 8 32 16 64
Итраконазол 0,5 8 32 16 64
64
Миконазол b 0,25 16 32 64 128
Флюцитозин

65 9015 b 9005

64 128 128 > 128
Тербинафин 8 32 128 4 16
9015 9015 9015 9015

9015 9015 9015 8 16

Ссылки

1.

Odds, F. C. (1988). Candida and Candidosis , 2-е изд. Баллиер Тиндалл, Лондон.

2.

Ло, Х. Дж., Колер, Дж. Р., Дидоменико, Б., Лёбенберг, Д., Каччапуоти, А. и Финк, Г. Р. (

1997

). Нефиламентные мутанты C. albicans являются авирулентными.

Ячейка

90

,

939


49. 3.

Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам. (1995). Эталонный метод для бульона

Разведение дрожжей на чувствительность к противогрибковым препаратам: предварительный стандарт M27-T. NCCLS,

Вилланова, П.А.

4.

Хосер, С., Франколини, М. и Ислам, К. (

1996

). Влияние противогрибковых средств на

морфогенетическая трансформация Candida albicans in vitro.

Журнал

Антимикробная химиотерапия

38

,

579

‐87. 5.

Керридж Д. (

1986

). Механизм действия клинически важных противогрибковых препаратов.

Достижения в физиологии микробов

27

,

1


72. 6.

Курц, М. Б., Хит, И. Б., Марринан, Дж., Дрейкхорн, С., Ониши, Дж. И Дуглас, К. (

1994

). Морфологические эффекты липопептидов против Aspergillus fumigatus коррелят

с активностью против (1,3) -β-d-глюкансинтазы.

Противомикробное средство

Агенты и химиотерапия

38

,

1480

-9. 7.

Vanden Bossche, H. (1988). Механизм действия пиридиновых, пиримидиновых и азольных противогрибковых средств.В Ингибиторы биосинтеза стеролов: фармацевтические и агрохимические аспекты (Berg, D. &

Plempel, M. Eds), стр. 79–119. VCH Publishers Inc., Нью-Йорк.

8.

Райдер, Н. С. (

1988

). Механизмы действия и биохимическая селективность

аллиламиновые антимикотические средства.

Анналы Нью-Йоркской академии наук

544

,

208

‐20.

Британское общество антимикробной химиотерапии

Способы действия и возможное воздействие на нецелевые микроорганизмы

Фунгициды широко используются для борьбы с грибковыми заболеваниями и увеличения урожайности сельскохозяйственных культур.Однако влияние фунгицидов на другие микроорганизмы, кроме грибов, остается неясным. Механизмы действия фунгицидов никогда не были хорошо классифицированы и представлены, что затрудняло оценку их возможных нецелевых эффектов. В этой статье были классифицированы способы действия и эффекты фунгицидов, нацеленных на компоненты клеточной мембраны, синтез белка, передачу сигнала, дыхание, митоз клеток и синтез нуклеиновых кислот, а также проанализировано их влияние на нецелевые микроорганизмы. При выборе фунгицида следует учитывать способы действия и потенциальное нецелевое воздействие на почвенные микроорганизмы, чтобы защитить биологические функции почвы и оптимизировать преимущества, получаемые от использования фунгицидов в сельскохозяйственных системах.

1. Введение

Почва, возможно, является наиболее важным ресурсом для производства продуктов питания. Это очень сложная система, функции которой зависят не только от ее физических свойств, но и от ее биологических компонентов. В частности, почвенные микроорганизмы играют важную роль в круговороте нескольких элементов, необходимых для жизни, включая C, N и P [1].

Понимание влияния фунгицидов на полезную деятельность микроорганизмов важно для оценки опасностей, связанных с фунгицидами, используемыми в сельском хозяйстве.Продуктивность сельскохозяйственных культур и экономическая отдача будут максимизированы за счет использования продуктов, контролирующих грибковые патогены, но сохраняющих полезные организмы. Различные организмы могут обладать идентичными или схожими механизмами и компонентами, а фунгициды, нацеленные на неспецифические участки связывания, могут напрямую воздействовать на нецелевые организмы. Например, токсичность фунгицидов карбоновых кислот проистекает из способности этих химикатов связываться с ДНК-топоизомеразой II как обычным ферментом, который раскручивает и разворачивает ДНК, обеспечивая синтез белка и репликацию ДНК.Этот фермент обнаружен не только в грибах, но и в прокариотических клетках [2]. Некоторые фунгициды глюкопиранозиловых антибиотиков токсичны для бактерий, в которых они могут подавлять синтез аминокислот [3]. Эти фунгициды также токсичны для некоторых не грибковых организмов высших эукариот [4].

Возможны также косвенные нецелевые эффекты. Микроорганизмы функционально или питательно связаны друг с другом, и изменения в компоненте микробного сообщества могут влиять на структуру всего сообщества.Это особенно верно в отношении ассоциированных с растениями микроорганизмов, которые влияют на метаболический статус растений [5–7].

Чтобы установить надлежащие правила использования многих фунгицидных веществ, продвигаемых промышленностью в устойчивом сельском хозяйстве, необходимо срочно прояснить способы фунгицидного действия и возможные побочные эффекты на немрибковые микроорганизмы. Способы действия фунгицидов никогда не были хорошо классифицированы, и побочные эффекты этих важных химических веществ до конца не изучены.Следовательно, использование фунгицидов может иметь негативные последствия, которые трудно предсказать [8]. В этой статье будут обобщены и систематизированы текущие знания о способах действия фунгицидов, влияющих на мембраны, нуклеиновые кислоты и синтез белка, трансдукцию сигналов, дыхание, митоз и деление клеток, а также активность мультисайтов, а также об их побочных эффектах на нецелевые организмы. . Основа этого анализа проливает столь необходимый свет на возможные побочные эффекты множества используемых фунгицидных продуктов и облегчает оценку рисков, связанных с их использованием.Информация, обобщенная здесь, будет способствовать развитию эффективных агроэкосистем, в которых сохраняется вклад природных биоресурсов.

2. Способы действия и побочные эффекты фунгицидных групп
2.1. Влияние на синтез липидов, стеролов и других компонентов мембраны

Клеточная мембрана представляет собой избирательно проницаемую стенку, отделяющую содержимое клетки от внешней среды. Мембраны выполняют множество биологических функций во всех живых клетках.Они препятствуют прохождению больших молекул, придают форму клетке, поддерживают водный потенциал клетки и участвуют в передаче сигналов [9]. Установлено, что негативное воздействие фунгицида на мембрану микроорганизмов изменяет структуру и функцию микробных сообществ почвы.

Структура липидов, основных компонентов клеточных мембран, была изменена фунгицидами из группы ароматических углеводородов (AH), что повлияло на функциональность микробных мембранных систем.Например, диклоран (2,6-дихлор-4-нитроанилин) — фунгицид AH, зарегистрированный в Северной Америке, Европе и Южной Африке с 1975 года для борьбы с базидиомицетами, дейтеромицетами, и видами Rhizopus [10] — фототоксичен. Клеточные мембраны обработанных грибов становятся чувствительными к солнечному излучению, которое затем разрушает структуру линолевой кислоты, обычного мембранного липида. Другой активный ингредиент фунгицида AH, этридиазол (5-этокси-3 (трихлорметил) -1,2,4-тиадиазол), вызывает гидролиз фосфолипидов клеточных мембран до свободных жирных кислот и лизофосфатидов [11], что приводит к лизису мембран, в грибах.Предыдущие исследования доказали, что эти фунгициды оказывают побочное действие на другие почвенные микроорганизмы. Диклоран может вызывать мутацию в Salmonella typhimurium , нарушая гидрофобные взаимодействия внутри мембраны [12]. Этридиазол также снижает скорость нитрификации аммонийокисляющих бактерий в почве [13], что, возможно, влияет на этот компонент микробного сообщества почвы и влияет на его структуру и функции.

Стерины — еще один важный компонент клеточной мембраны грибов.Фунгициды, ингибирующие деметилирование (DMI), подавляют биосинтез стеролов в клетках грибов. Триадимефон (( RS ) -1- (4-хлорфенокси) -3,3-диметил-1- (1 H -1,2,4-триазол-1-ил) бутан-2-он) деметилированный по C-14, вводит двойную связь в C-22 и восстанавливает двойную связь в C-24 в углеродном скелете стеролов в мембране грибка, вызывая дисфункцию и лизис клеток [14]. Хотя бактерии не содержат стеринов, фунгициды, нацеленные на стерины, оказывают косвенное побочное действие на эти микроорганизмы.Исследования показали, что триадимефон оказывает долгосрочное ингибирующее действие на бактериальное сообщество почвы [7]. Тритиконазол (( RS ) — ( E ) -5- (4-хлорбензилиден) -2,2-диметил-1- (1 H -1,2,4-триазол-1-илметил) циклопентанол) , триазоловый фунгицид, может стимулировать размножение бактерий в почве [15], в то время как два других фунгицида, нацеленных на стеролы, фенпропиморф ( цис -4 — [( RS ) -3- (4- трет -бутилфенил) — 2-метилпропил] -2,6-диметилморфолин) и пропиконазол ((2 RS , 4 RS ; 2 RS , 4 SR ) -1- [2- (2,4-дихлорфенил) -4 -пропил-1,3-диоксолан-2-илметил] -1 H -1,2,4-триазол), подавлял общую бактериальную активность [16].Такой дифференцированный эффект можно объяснить изменением конкуренции между разными почвенными микроорганизмами. Недавнее исследование диметоморфа (( EZ ) -4- [3- (4-хлорфенил) -3- (3,4-диметоксифенил) акрилоил] морфолина) показало, что этот фунгицид может влиять на активность бактерий, участвующих в N-цикле, с воздействием на нитрификацию и аммонификацию [17] через различное воздействие на разные бактериальные экотипы и изменения в структуре бактериального сообщества.

Некоторые фунгициды нацелены на внутриклеточные мембранные системы грибов и их биологические функции.Широко используемое фунгицидное соединение, акрифлавин (3,6-диамино-10-метилакридин-10-иум хлорид), увеличивает проницаемость митохондрий и высвобождает цитохром с в клетках грибов, подавляя активацию рецепторов плазматической мембраны, нарушая порядок протонного потока и разрушая электрохимический протонный градиент. через митохондриальные мембраны [18]. Как следствие, синтез АТФ снижается, что приводит к гибели клеток. Было также показано, что акрифлавин может утолщать как периферическую, так и поперечную клеточную стенку грамотрицательных бактерий Staphylococcus aureus [18], что указывает на возможность нецелевого воздействия акрифлавина на рост бактерий (Таблица 1).

9218 Липидная мембрана, другие компоненты липидов

Триадон

Долговременный эффект

Сообщество почвенных бактерий [7]

02 90 [17]

Сигнал трансдукции пирролы 2-дезингибиторы 2-де-карбокси Боскалид

оксидные бактерии

, не вызывающие осаждения,

, оксидирование,

, 6-динитроанилины

4 [31]

9014

активность бактерий, связанных с круговоротом азота [29] ] в почвах

902

Сульфат меди

стрептомицеты в песчаной почве [35]

Режим действия Химическая группа фунгицидов Общее название Нецелевые эффекты

углеводородов Диклоран Мутаген до Salmonella typhimurium [12]
Этридиазол Замедляет нитрификацию, воздействуя на окислители аммония [13]
Стерол

Тритиконазол Увеличивает общее количество бактерий в почве [15]
Амид коричной кислоты Диметоморф Влияет на нитрифицирующую и аммонифицирующую активность бактерий в песчаных почвах
Триазол Гексаконазол Влияет на активность бактерий, связанную с N-циклированием [19]
Морфолин Фенпропиморф Подавляет общую бактериальную активность на водно-болотных угодьях [16]
Триазол Пропиконазол
Тебуконазол Может замедлять стимулирующее рост растений действие Azospirillum brasilenseular на его компоненты мембраны 9214 901 Гидрохлорид Акрифлавин Утолщает периферическую и поперечную клеточную стенку Staphylococcus aureus [18]

Синтез аминокислот и белков синтезируется в бактериях [3] и нейротоксичен для амфибий [4]
Тетрациклиновый антибиотик Окситетрациклин Также используется в качестве бактерицида [21]
Флудиоксонил Токсичен для водорослей [22] и потенциальный риск для прокариот [23]
Дикарбоксимиды Ипродион Влияет на передачу сигнала в бактериях [24]

Ингибирует общий рост бактерий [24] 25]

Дыхание Ингибиторы НАДН-оксидоредуктазы (Комплекс I) Пиримидинамины Дифлуметорим Неизвестно
Может влиять на рост прокариот [26]
Бензамиды Флутоланил
Гксатиин карбоксамиды Карбоксин Ингибирует денитрифицирующие Флуазинам Обладают потенциальным риском для микроорганизмов окружающей среды [27]
Динитрофенилкротонат Динокап Подавляет активность аммонифицирующих бактерий и стимулирует общее бактериальное дыхание в почве [27]
Митоз и деление клеток Ингибитор сборки микротрубочек веретена Карбамат метилбензимидазола Беномил Может воздействовать на нитрифицирующие бактерии [29] и арбускулярные микоризные грибы [30]
Фенилмочевина Pencycuron Может кратковременно воздействовать на метаболически активированные почвенные бактерии [32]

Синтез нуклеиновых кислот РНК-полимеразы I-

Ингибиторы талаксил Влияет на деятельность аммонифицирующих и нитрифицирующих бактерий в почве [33]
Оксазолидиноны Оксадиксил Неизвестно
Ингибиторы аденозин-дезаминазы 9014
Фталонитрил Хлороталонил Влияет на активность бактерий, связанную с круговоротом азота [29]
Мультисайтовую активность Дитиокарбамат Манкоцеб

Фталимид Каптан Подавляет денитрифицирующую активность бактерий [16]
Дитиокарбамат Тирам
Антрахинон Дитианон Уменьшает разнообразие бактерий в почве [34]

2.2. Воздействие на аминокислоты и синтез белков

Белки являются наиболее важными строительными блоками в живых организмах. Они выполняют различные важные биологические функции, такие как создание цитоскелета, передача сигналов между клетками и катализирование биохимических реакций [36]. Белки состоят из аминокислот. Некоторые фунгициды нарушают биосинтез аминокислот и белков, влияя на биологические функции пораженных организмов.

Стрептомицин (5- (2,4-дигуанидино-3,5,6-тригидроксициклогексокси) -4- [4,5-дигидрокси-6- (гидроксиметил) -3-метиламинотетрагидропиран-2-ил] окси -3-гидрокси-2-метил-тетрагидрофуран-3-карбальдегид), антибиотик, продуцируемый Streptomyces griseus , который долгое время использовался в качестве фунгицида [37], также обладает бактерицидной активностью.Стрептомицин препятствует синтезу аминокислот. У Escherichia coli применение стрептомицина вызвало неправильное включение молекулы изолейцина в полипептидную цепь фенилаланина, связанную с 70S рибосомами [38]. Другое исследование мутантного штамма thermus thermophilus показало, что неправильное считывание генов, кодирующих синтез аминокислот, объясняет негативное влияние стрептомицина на бактерии [3]. Кроме того, Perez et al. [4] обнаружили, что стрептомицин также может быть антагонистом рецепторов неселективных возбуждающих аминокислот (ЕАА).Этот антибиотик избирательно блокировал аминокислотные рецепторы в передних вестибулярных нервных волокнах саламандры Ambystoma tigrinum , что позволяет предположить, что он также может быть токсичным для эукариот, а также для грибов и бактерий.

Окситетрациклин ((2Z, 4S, 4aR, 5S, 5aR, 6S, 12aS) -2- [амино (гидрокси) метилиден] -4- (диметиламино) -5,6, 10,11, 12a-пентагидрокси-6- метил-4,4a, 5,5a-тетрагидротетрацен-1,3,12-трион) широко используется в сельском хозяйстве из-за его антибиотической активности широкого спектра действия.Он также зарегистрирован как фунгицид в Новой Зеландии и Вьетнаме, согласно информации, предоставленной Сетью действий против пестицидов Северной Америки (http://www.pesticideinfo.org/Detail_ChemReg.jsp?Rec_Id=PC38140). В предыдущих исследованиях сообщалось об ингибирующем влиянии окситетрациклина на синтез белка в бактериях за счет вмешательства в связывание тройного комплекса амино-ацил-тРНК с акцепторным сайтом рибосом [39], что приводило к задержке роста бактерий, нарушению структуры микробного сообщества и ограниченной активности микробного эктофермента. в почвенной системе [21, 40].Поэтому следует соблюдать осторожность при применении окситетрациклина для борьбы с грибковыми заболеваниями, поскольку он является антибиотиком и воздействует на бактерии.

2.3. Влияние на передачу сигнала

Фунгицид, влияющий на микробные мембраны или белки, как мы обсуждали выше, может влиять на передачу сигнала, которая происходит на уровне мембран и затрагивает функцию определенных белков.

Фенилпиррол фунгицидный ингредиент флудиоксонил (4- (2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил) -1 H -пиррол-3-карбонитрил) является несимметричным фунгицидом, также известным как пути передачи сигналов грибами-мишенями [41].Работа Rosslenbroich и Stuebler [42] выявила ингибирование прорастания спор, удлинения зародышевой трубки и роста мицелия у Botrytis cinerea за счет влияния флудиоксонила на путь передачи осморегуляторного сигнала этого гриба. Этот вывод был подтвержден Ochiai et al. [43], которые обнаружили, что флудиоксонил может нарушать путь передачи сигнала CANIKI / COSI, приводя к дисфункции синтеза глицерина и ингибированию образования гиф у Candida albicans .Недавно Hagiwara et al. [44] сообщили об ингибирующем действии флудиоксонила на большое количество генов, участвующих в системе двухкомпонентной передачи сигнала, у мицелиальных грибов. Воздействие на эту систему предполагает, что флудиоксонил может оказывать нецелевое действие на бактерии, поскольку этот двойственный механизм передачи сигнала также обнаружен у прокариот [45].

Влияние на передачу сигнала обнаруживается также у дикарбоксимидных фунгицидов. Ипродион (3- (3,5-дихлорфенил) — N -изопропил-2,4-диоксоимидазолидин-1-карбоксамид), контактный дикарбоксимидный фунгицид, широко используемый в различных сельскохозяйственных культурах, подавляет синтез глицерина и развитие гиф путем срезания сигнальной трансдукции [43], как и флудиоксонил.Как сообщается в недавнем исследовании [24], ипродион может изменять структуру бактериального сообщества почвы. Вмешательство в передачу сигнала дикарбоксимидным фунгицидом винклозолином (( RS ) -3- (3,5-дихлорфенил) -5-метил-5-винил-1,3-оксазолидин-2,4-дионом) вызвало низкую скорость роста, аномалия и изменения в продукции гексоз и хитина у обработанных B. cinerea [46]. Винклозолин также оказывает ингибирующее действие на рост почвенных бактерий и метаболизм азота в почвенных системах [25].Метаболит этого фунгицидного соединения, 3,5-дихлоранилин, также токсичен и устойчив [23], что также указывает на возможное воздействие фунгицида винклозолин на нецелевые почвенные организмы.

2.4. Влияние на дыхание

Сообщалось о том, что несколько фунгицидов с различными механизмами действия подавляют микробное дыхание. Некоторые из них являются ингибиторами НАДН-оксидоредуктазы (Комплекс I), другие — ингибиторами сукцинат-дегидрогеназы (Комплекс II), ингибиторами цитохрома bc1 (Комплекс III) и разобщителями окислительного фосфорилирования.

До сих пор сообщалось только о нескольких фунгицидах, ингибирующих дыхание, воздействуя на систему Комплекса I в митохондриях грибов. Дифлуметорим (( RS ) -5-хлор- N — {1- [4- (дифторметокси) фенил] пропил} -6-метилпиримидин-4-иламин), впервые зарегистрированный в Японии в 1997 году для борьбы с мучнистой росой и ржавчина декоративных растений [47] ингибирует активность НАДН-оксидоредуктазы, что приводит к гибели грибов [48]. Механизм действия ингибиторов Комплекса I изучался в очень ограниченных исследованиях, который остается плохо изученным.

Три широко используемых ингибитора Комплекса II, боскалид (2-хлор- N — (4′-хлорбифенил-2-ил) никотинамид), карбоксин (5,6-дигидро-2-метил-1,4-оксатиин- 3-карбоксанилид) и флутоланил ( α , α , α -трифтор-3′-изопропокси- или -толуанилид), вызывают дисфункцию сукцинатдегидрогеназы (SDH) в трикарбоновом электронном цикле и трикарбоновом цикле. цепи, подавляя активность Комплекса II и дыхание в клетках грибов [49–52].Сообщалось о значительном увеличении урожайности при использовании этих фунгицидов, что указывает на их эффективность в борьбе с грибковыми заболеваниями [53, 54]. Поскольку Комплекс II является общей системой ферментных комплексов, существующей во многих эукариотических и прокариотических организмах [26], неоднократно сообщалось о нецелевых эффектах ингибиторов Комплекса II на почвенные бактерии [55, 56], что позволяет предположить, что с этими химическими веществами следует соблюдать осторожность.

В то время как некоторые фунгициды влияют на дыхание грибов на уровне комплексной системы ферментов, другие фунгициды могут влиять на дыхание через другие мишени.Флуазинам (3-хлор- N — (3-хлор-5-трифторметил-2-пиридил) — α , α , α -трифтор-2,6-динитро- p -толуидин) запускает очень необычную разобщающую активность в клетках-мишенях. Было обнаружено, что метаболическое состояние их митохондрий ингибируется после воздействия флуазинама, что может быть вызвано конъюгацией химического вещества с глутатионом в митохондриях [57]. Следовательно, производство АТФ ингибируется, а последующий клеточный метаболизм прерывается.Фактически, была обнаружена разобщающая активность восьми производных флуазинама [58], что позволяет предположить, что флуазинам имеет сложные ответвления на метаболические пути грибов и может быть токсичным в окружающей среде [27]. Другой фунгицид динокап ( RS ) -2,6-динитро-4-октилфенилкротонаты и ( RS ) -2,4-динитро-6-октилфенил) продемонстрировал действие, аналогичное флуазинаму, который ингибировал аммонифицирующую бактериальную активность [28 ], предполагая побочные эффекты этой группы фунгицидов на рост бактерий.

2,5. Влияние на митоз и деление клеток

Известно, что фунгициды метилбензимидазола карбамата (МБК) влияют на митоз и деление клеток у грибов-мишеней [59, 60]. Предыдущие исследования показали ингибирующее действие этих фунгицидов на полимеризацию тубулина в микротрубочки. Эти фунгициды MBC связываются с β -тубулином в микротрубочках, ингибируя их пролиферацию и подавляя их динамическую нестабильность [61–63]. Микротрубочки представляют собой полимеры цитоскелета в эукариотических клетках и, таким образом, играют жизненно важную роль во многих клеточных функциях.Применение фунгицидов MBC подавляет сборку микротрубочек веретена, нарушает выравнивание хромосом в метафазной пластинке и взаимодействия микротрубочки-кинетохоры, вызывая потерю хроматид, потерю хромосом или нерасхождение в клетках-мишенях [64], что также может оказывать побочные эффекты на другие микроорганизмы, например описано ниже.

Беномил (метил-1- (бутилкарбамоил) бензимидазол-2-илкарбамат) и карбендазим (метилбензимидазол-2-илкарбамат), два очень популярных фунгицида МБК, широко используемых в растениеводстве, ингибируют митоз у грибов.Они также могут влиять на полезные грибы арбускулярной микоризы (AMF) [30] и клетки млекопитающих [65, 66]. Хотя пока не поступало никаких доказательств прямого воздействия фунгицидов МБК на почвенные бактерии, некоторые исследования связывают эти фунгициды с ингибированием нитрификации в почве — микробиально-опосредованного процесса [29]. Влияние фунгицидов МБК на бактерии и другие почвенные организмы еще предстоит выяснить.

2.6. Влияние на синтез нуклеиновых кислот

Фунгициды фениламидов (PA) влияют на синтез нуклеиновых кислот, подавляя активность системы РНК-полимеразы I.Например, металаксил (метил N — (метоксиацетил) — N — (2,6-ксилил) -DL-аланинат), широко используемый фунгицид PA, ингибирует включение уридина в цепь РНК [67]. Он препятствует синтезу нуклеиновых кислот за счет ингибирования активности РНК-полимеразы I, тем самым блокируя синтез рРНК на уровне транскрипции уридина [68]. Применение фунгицидов PA может увеличить распространенность устойчивости к фунгицидам в популяции патогенов и дать более устойчивые к фунгицидам изоляты, как показано в недавнем исследовании с использованием маркеров AFLP (полиморфизм длины амплифицированного фрагмента) и SSR (простые повторы последовательности) [69].Фунгициды из группы PA следует использовать с осторожностью, поскольку сообщалось о побочном эффекте этого фунгицида на бактерии, связанные с циклическим N-циклом [33].

О фунгицидах гидроксипиримидинов также сообщалось за их ингибирующее действие на аденозиндезаминазу. В качестве примера сообщалось о воздействии этиримола (5-бутил-2-этиламино-6-метилпиримидин-4-ол) на несколько метаболитов, таких как нуклеотиды инозина и аденина, при мучнистой росе ячменя ( Erysiphe graminis f.sp. Ордеев .) [70]. Этиримол вызывает сверхэкспрессию аденинфосфорибозилтрансферазы, что может еще больше нарушить баланс пула нуклеотидов. Кроме того, этиримол ингибировал АДАазу, катализирующую гидролитическое дезаминирование аденозина. Следовательно, производство инозина было прекращено, и синтез нуклеиновой кислоты был нарушен. Ген, ответственный за устойчивость к этиримолу, ethIS , был позже описан у Erysiphe graminis f.sp. hordei [71]; поэтому следует соблюдать осторожность при применении фунгицидов гидроксипиримидинов, поскольку устойчивость к фунгицидам у целевых популяций может развиться при многократном применении фунгицидов.

2.7. Фунгициды с множественной активностью

Фунгициды с множественной активностью широко используются в агрономической деятельности из-за широкого спектра действия по борьбе с болезнями, но могут оказывать побочные эффекты на другие микроорганизмы из-за их воздействия на множественные биохимические участки. Хлороталонил (тетрахлоризофталонитрил), широко используемый фунгицид фталонитрила, может блокировать трансформацию альтернативной особой структуры глутатиона и снижать активность ферментов, которые использовали особую конформацию глутатиона в качестве своих реакционных центров.Предыдущие исследования показали, что хлороталонил может влиять на рост бактерий в почве, что может иметь экологические последствия для круговорота азота [29]. Манкоцеб (комплекс этиленбис (дитиокарбамата) (полимера) марганца с солью цинка), еще один фунгицид с мультисайтовой активностью, влияющий на метаболизм в клетках-мишенях, также может влиять на бактерии, участвующие в круговороте углерода и азота в почве [17, 28]. Другие фунгициды с мультисайтовой активностью, такие как каптан ( N -циклогекс (трихлорметилтио) -4-ен-1,2-дикарбоксимид) и тирам (бис (диметилтиокарбамоил) дисульфид), подавляли рост денитрифицирующих бактерий [16], возможно, из-за их неспецифическое воздействие на биохимические соединения, содержащие тиол в клетках-мишенях.Кроме того, фунгицид Multisite на основе меди, такой как сульфат меди (тетраоксосульфат меди (II)), подавляет рост бактерий и стрептомицетов в почве [35] и может оказывать нецелевое воздействие на другие почвенные микроорганизмы.

3. Заключение

Фунгицидные соединения могут иметь побочные эффекты и воздействовать на нецелевые почвенные микроорганизмы. Воздействие фунгицидов на почвенные микроорганизмы может быть важным, так как обратная связь почвенного микробного сообщества может повлиять на рост сельскохозяйственных культур и производство в системах земледелия.Связи, существующие между фунгицидами, почвенными микроорганизмами и другими факторами окружающей среды, сложны и трудно предсказуемы. С другой стороны, разнообразие способов действия фунгицидов увеличивает сложность оценки рисков, связанных с использованием фунгицидов. Поскольку желательно оптимизировать преимущества естественных биологических функций почвы для растениеводства, понимание механизма действия фунгицидов и их влияния на метаболизм может помочь нам более разумно использовать фунгициды в сельском хозяйстве.

Выражение признательности

Авторы выражают признательность за финансовую поддержку компаниям Novozymes, Saskatchewan Pulse Growers, а также Инициативе по согласованию инвестиций в сельское хозяйство и агропродовольствие Канады.

Влияние фунгицидов на состав грибкового сообщества в филлосфере пшеницы

Цитирование: Карлссон И., Фриберг Х., Стейнберг С., Перссон П. (2014) Влияние фунгицидов на состав грибкового сообщества в филлосфере пшеницы. PLoS ONE 9 (11):
e111786.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111786

Редактор: Ньютон С. М. Гомеш, Университет Авейру, Португалия

Поступила: 18 июня 2014 г .; Одобрена: 5 октября 2014 г .; Опубликован: 4 ноября 2014 г.

Авторские права: © 2014 Karlsson et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе результатов, полностью доступны без ограничений. Данные секвенирования доступны в архиве чтения последовательностей (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) под регистрационным номером SRP042192.

Финансирование: Исследование финансировалось Шведским исследовательским советом по окружающей среде, сельскохозяйственным наукам и пространственному планированию (http://www.formas.se/en/), регистрационный номер 2010-1945. Спонсор не принимал участия в планировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Филосфера, определяемая как совокупность надземных частей растений, обеспечивает среду обитания для многих микроорганизмов [1]. Было показано, что филлосферные микроорганизмы, включая грибы, выполняют важные экологические функции и могут быть как полезными, так и вредными для своего растения-хозяина [2]. В сельскохозяйственных культурах некоторые филлосферные грибы являются важными патогенами, тогда как другие обладают антагонистическими свойствами [3] или могут влиять на физиологию растения [4].Понимание влияния сельскохозяйственных методов на филлосферные грибные сообщества важно для создания наилучших условий для развития сельскохозяйственных культур.

Пшеница — одна из самых важных сельскохозяйственных культур во всем мире, и грибное сообщество, связанное с пшеницей, было одним из первых филлосферных сообществ, которые были изучены [5]. Было обнаружено, что филлосфера пшеницы содержит множество дрожжей базидиомицетов, таких как Cryptococcus spp., Sporobolomyces roseus и нитчатые сапротрофы, например, Cryptococcus spp.г. Cladosporium spp., Alternaria spp., Epicoccum spp. И патогены растений [5] — [8]. Грибы могут присутствовать на листьях пшеницы как в виде эпифитов, так и эндофитов. Это отражается в различных наборах грибов, полученных при культивировании промытых кусочков листьев, по сравнению с жидкостью для мытья листьев [9]. Основные компоненты грибкового листового сообщества пшеницы различаются по результатам исследований, проведенных на разных участках и в разное время, а механизмы, лежащие в основе динамики грибных сообществ в филлосфере сельскохозяйственных культур, до конца не изучены.

Растительные патогены — важная и хорошо изученная группа микроорганизмов, связанных с пшеницей. К важным грибковым заболеваниям листьев пшеницы во всем мире относятся различные виды ржавчины ( Puccinia spp.), Мучнистая роса ( Blumeria graminis ) и болезни листовой пятнистости, такие как septoria tritici blotch ( Mycosphaerella graminicola ( Zymoseptoria). . Пятнистость Septoria tritici является одним из наиболее серьезных заболеваний европейской пшеницы с начала 1980-х годов, вызывая потери урожая до 50% [10].

Фунгициды для листьев обычно используются в традиционном сельском хозяйстве для борьбы с грибковыми заболеваниями. Однако помимо желаемого воздействия на грибковые патогены, нецелевые грибы также подвергаются обработке фунгицидами. Важно понимать действие фунгицидов на нецелевые грибы, учитывая антагонистический потенциал некоторых филлосферных грибов и взаимодействия между различными патогенами [1], [11]. Применение фунгицида для борьбы с одним патогеном может даже усугубить проблемы с другим, как было показано для Fusarium spp.вызывает фузариоз злаков [12], [13]. Было высказано предположение, что фунгициды подавляют сапротрофные грибы, которые в противном случае действовали бы как конкуренты против Fusarium [13]. С другой стороны, было показано, что сапротрофы филлосферы ускоряют старение листьев, что может объяснить некоторое увеличение урожайности после обработки фунгицидами, которое не объясняется атакой патогенов [9], [14]. Дополнительные знания о влиянии фунгицидов на сообщества филлосферных грибов важны для оптимизации стратегий применения фунгицидов.

Фунгициды имеют разные механизмы действия и могут быть как широкого спектра действия, так и нацелены на конкретную группу грибов [15], а тип фунгицида и использование варьируются для разных культур. Предыдущие исследования, посвященные изучению фунгицидного воздействия на нецелевые грибы в филлосфере пшеницы с использованием культурально-зависимых методов, показали, что фунгициды с различными механизмами действия по-разному влияют на отдельные таксоны грибов [7] — [9], [16] — [18] . Некоторые из предубеждений, связанных с методами, зависящими от культуры, можно преодолеть с помощью методов на основе ДНК.Недавно технологии высокопроизводительного секвенирования произвели революцию в изучении микробного разнообразия в филлосфере. Следовательно, знания о бактериальных филлосферных сообществах сельскохозяйственных культур растут, но меньше известно о грибах [19]. До сих пор влияние фунгицидов на грибковые сообщества в филлосфере было изучено лишь в ограниченной степени с использованием методов ДНК-отпечатков [20], [21] и высокопроизводительного секвенирования [22], но ни одно из этих исследований не было сосредоточено на злаках.

Целями данного исследования были: 1) выявление грибкового сообщества в филлосфере пшеницы с использованием высокопроизводительного секвенирования 454, 2) изучение влияния фунгицидов на состав грибного сообщества в филлосфере пшеницы и 3) изучение различий между филлосферные грибные сообщества в двух областях, характеризующихся разными климатическими условиями и режимами ведения сельского хозяйства. Образцы листьев, обработанных фунгицидами и не обработанных фунгицидами, были взяты с полей озимой пшеницы в двух областях в Швеции, и состав грибкового сообщества на листьях был проанализирован путем амплификации и секвенирования 454 грибковой области ITS2 рибосомной ДНК.

Материалы и методы

Заявление об этике

Разрешение от фермеров было получено через Центры защиты растений Шведского управления сельского хозяйства в Скаре (для северных районов) и Алнарпа (для южных районов) соответственно. В исследовании не участвовали какие-либо охраняемые или находящиеся под угрозой исчезновения виды.

Отбор проб и растительный материал

Отбор проб пшеничных полей проводился в двух важных сельскохозяйственных производственных районах Швеции: на северном участке отбора проб, расположенном в районе Вестергётланд, и на южном участке отбора проб в регионе Сконе (рис.1). Южный регион отличается более мягким и сухим климатом. Эти две области также различаются в управлении сельским хозяйством, например, с точки зрения последовательности возделывания культур [23], выбор сорта пшеницы и фунгициды чаще используются в южных регионах [24]. Средняя урожайность озимой пшеницы примерно на 2000 кг / га выше в южных регионах [23]. На момент отбора проб поля в северном районе достигли цветения, в то время как в южном районе стадия развития варьировалась от стадии цветения до стадии раннего созревания теста (Таблица 1).

Рис. 1. Образцы листьев пшеницы были взяты в двух важных сельскохозяйственных районах Швеции.

Точки представляют положение отдельных полей в двух областях выборки. Северная область отбора проб (N) расположена в регионе Вестергётланд, а южная область (S) — в регионе Сконе.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111786.g001

Листья

пшеницы ( Triticum aestivum ) были отобраны на участках по надзору за вредителями, для борьбы с болезнями и проведения сортоиспытаний на традиционно управляемых фермерских полях летом 2011 года.Участки надзора за вредителями используются для мониторинга распространения вредителей и болезней, поэтому фунгициды или инсектициды на этих участках не применяются. Образцы листьев семи различных сортов озимой пшеницы были собраны с 18 полей (Таблица 1).

Все поля были обработаны 1–3 фунгицидами, содержащими один или несколько из следующих активных ингредиентов: азоксистробин, биксафен, ципродинил, дифеноконазол, фенпропиморф, метрафенон, пикоксистробин, прохлораз, пропиконазол, протиоконазол и пираклостробин (подробнее см. ).На полях с участками надзора за вредителями внесение фунгицидов за пределы участков осуществлялось фермером. При полевых испытаниях применение фунгицидов проводилось руководящим персоналом полевых испытаний.

Лист под флаговым листом был взят из 10 случайно выбранных растений на каждом участке. Для участков наблюдения за вредителями образцы растений отбирали из обработанных фунгицидами сельскохозяйственных культур за пределами участка и на самом участке наблюдения, не обработанном фунгицидами. В полевых испытаниях образцы растений отбирали с участков, обработанных фунгицидами, и с необработанных контрольных участков.Однако не было доступного необработанного участка на одном поле в южной части. Листья с каждого участка объединяли в один образец. Всего для исследования было использовано 42 образца (табл. 1) и 420 листьев. При сборе листьев использовались перчатки, чтобы избежать перекрестного заражения между обработанными фунгицидами и необработанными листьями, а также между полями. Листья собирали в чистые пластиковые пакеты и хранили в течение ночи в холодильнике, а затем переносили при -20 ° C до экстракции ДНК.

Извлечение ДНК, ПЦР-амплификация и секвенирование

Чтобы уловить как эндофитные, так и эпифитные грибы, всю ткань листа использовали для экстракции ДНК.Листья делили пополам, средняя жилка оставалась на той половине, которая использовалась для экстракции. Десять разрезанных пополам листьев разрезали на более мелкие кусочки и поместили в пластиковый пакет. Образцы замораживали в жидком азоте, гомогенизировали пестиком и по 100 мг каждого образца переносили в другой мешок (Bioreba AG, Швейцария). Затем ДНК экстрагировали с помощью набора DNeasy Plant Mini (QIAGEN AB, Швеция) в соответствии с инструкциями производителя, за исключением буфера для лизиса, для которого использовали больший объем (530 мкл).Набор DNeasy использовался с QiaCube (QIAGEN AB, Швеция) со стандартным протоколом растительных клеток и тканей.

Область ITS2 амплифицировали на термоциклере 2720 (Life Technologies, Калифорния, США) с использованием прямого праймера fITS7 (GTGARTCATCGAATCTTTG; [25] и обратного праймера ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC; [26]). Длина ITS2 варьируется среди грибов, от ∼122 до 245 п.н. [25]. Праймер ITS4 был помечен штрих-кодом из 8 п.н. ПЦР проводилась в 50-мкл реакции с 0,8 нг / мкл матрицы, 200 мкМ каждого нуклеотида, 2.75 мМ MgCl 2 , прямой праймер при 500 нМ, меченый праймер при 300 нМ и 0,02 ед. / Мкл полимеразы (DreamTaq Green, Thermo Scientific, Массачусетс, США) в буфере для ПЦР. Условия ПЦР: 5 мин при 94 ° C, 30–32 цикла [30 с при 94 ° C, 30 с при 57 ° C, 30 с при 72 ° C] и 7 мин при 72 ° C. Количество циклов было адаптировано для каждого образца, чтобы получить полосы от слабой до умеренно сильной на агарозном геле с примерно одинаковой силой для всех образцов, чтобы избежать перенасыщения и искажения пула ПЦР. Чтобы определить количество циклов, необходимых для каждого образца, тестовые прогоны были проведены с праймерами без штрих-кода, начиная с 25 циклов ПЦР перед тем, как образцы были обработаны с праймерами со штрих-кодом.

продуктов ПЦР очищали с помощью AMPure (Beckman Coulter, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Массачусетс, США), и образцы объединяли в эквимолярных количествах. Пул образцов лиофилизировали и отправляли в LGC Genomics (Германия) для лигирования адаптера и секвенирования на 1/16 th планшета на секвенаторе GS FLX Titanium (Roche, Швейцария). Демультиплексированные необработанные данные последовательности были депонированы в архиве чтения последовательностей (http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) под регистрационным номером SRP042192.

Биоинформатика и систематика

Необработанные данные последовательности были проанализированы с использованием конвейера SCATA (http://scata.mykopat.slu.se; [27]). Последовательности были проверены на наличие тегов и последовательностей праймеров, что позволило выявить одно несоответствие для праймеров в дополнение к вырожденным основаниям. Последовательности короче 200 п.н. и последовательности со средней оценкой качества ниже 20 и содержащие основания с оценкой ниже 10 отбрасывали.Использовалась опция «извлечь регион высокого качества».

Последовательности были сгруппированы в операционные таксономические единицы (OTU) на уровне кластеризации, который был выбран для приближения к уровню вида. Последовательности, прошедшие контроль качества, были кластеризованы с отсечкой несходства 1,5% в SCATA с использованием кластеризации по одиночным связям с настройками по умолчанию (выравнивание 85%, коллапс гомополимеров до 3 пар оснований, поиск использования в качестве механизма кластеризации, штраф за несоответствие 1, штраф за открытие пробела 0 , удлинение зазора 1 и вес концевого зазора 0).Уровень внутривидовой изменчивости в последовательности ITS варьируется в пределах грибов [28], и, таким образом, использование единого порогового уровня не будет полностью отражать биологические виды. Однако мы обнаружили, что различие в 1,5% является наиболее подходящим уровнем в этом наборе данных, поскольку более высокие пороговые значения могут сгруппировать некоторые виды базидиомицетов в одну и ту же OTU.

синглтонов из полного набора данных были удалены, так как многие из них считались отражающими ошибки секвенирования [29]. Кроме того, синглтоны в каждом образце были удалены, чтобы ограничить эффекты переключения тегов [30].

Мы сосредоточились на таксономическом назначении OTU, представленных как минимум 10 последовательностями в глобальном наборе данных (67 OTU). Некоторые из них можно таксономически присвоить в SCATA, включив эталонные последовательности из изолятов из Центра биоразнообразия грибов CBS (http://www.cbs.knaw.nl/) и из базы данных UNITE, включая образцы «гипотез видов» (версия 6 09.02). .2014; [31]) в кластеризации. Kõljalg и др. . [31] ввели термин «видовая гипотеза» (SH), чтобы облегчить передачу таксонов грибов, обнаруженных при кластеризации последовательностей ДНК с разными пороговыми значениями сходства.Стабильные коды доступа для всех гипотез видов в базе данных UNITE были введены [31], что облегчает сравнение между исследованиями грибов на основе последовательностей.

OTU, которые не кластеризовались с какой-либо эталонной последовательностью в SCATA, были обработаны против GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) для поиска подходящих эталонных последовательностей. Для этой цели использовалась наиболее многочисленная последовательность в каждой OTU. Затем таксономическое присвоение было выполнено с помощью деревьев объединения соседей (рис.S1 и S2). Сначала ОТЕ были разделены на базидиомицеты и аскомицеты. Затем в автономной версии MAFFT (v7.058b; [32]) было произведено множественное выравнивание для каждого типа с использованием опции G-IN-Si. Выравнивания вырезали так, чтобы все последовательности имели одинаковую длину. Впоследствии деревья объединения соседей были построены с помощью опции ProtDist / FastDist + BioNJ на веб-сервисе phylogeny.fr (http://www.phylogeny.fr; [33]) с использованием 1000 бутстрапов. OTU были отнесены к наиболее точному таксономическому уровню.

Статистический анализ

Сначала была проанализирована взаимосвязь между глубиной секвенирования и богатством OTU с использованием кривых разрежения для каждой области и обработки, созданных с помощью Analytical Rarefaction 1.3 (Стивен М. Холланд, 2003, http://strata.uga.edu/software/anRareReadme.html) с шагом 1000 экз. Связь между количеством образцов и богатством OTU была проанализирована с помощью кривых накопления видов. Распределение обработанных и необработанных образцов было неравномерным в двух областях отбора проб.Поэтому, когда на поле было взято более двух образцов, из каждого поля случайным образом были выбраны один обработанный фунгицидом и один необработанный образец для включения в анализ. Кривые накопления видов были построены с использованием функции specaccum случайным методом в пакете Vegan (версия 2.0–10; [34]) в R (версия 3.0.2)

.

Поскольку количество последовательностей в выборке было неравным, набор данных был сокращен до 197 последовательностей в выборке, что было размером самой маленькой выборки.Разрежение выполнялось с использованием функции rrarefy в «Vegan» (версия 2.0–10; [34]). Разрежение было повторено 1000 раз в таблице выборки за OTU, и среднее значение было взято по 1000 матрицам и использовано для последующего анализа.

Во-вторых, мы проверили влияние обработки фунгицидами и географического района на богатство OTU и равномерность сообщества (индекс равномерности Пиелу [35]) с использованием линейных смешанных моделей (LMM). Мы использовали функцию lmer в пакете «lme4» R [36].Модель, включающая лечение, географический район и их взаимодействие, с полем и взаимодействие между полем и лечением в качестве случайных факторов, была адаптирована как к богатству, так и к равномерности OTU. Тесты значимости были выполнены с модификацией Kenward-Roger для выполнения F-тестов, функцией KRmodcomp в пакете «pbkrtest» [37]. LMM-анализ проводился как для полного набора данных, так и для меньшего набора данных, за исключением двух полей в южной части, где в контрольных образцах преобладала одна OTU, а именно Puccinia striiformis.

Третье, неметрическое многомерное масштабирование (NMDS) было использовано для изучения состава грибкового сообщества с использованием функции metaMDS в пакете ‘Vegan’ [34] в R. NMDS был выполнен с использованием различий Брея-Кертиса с преобразованием квадратного корня. и двойная стандартизация Висконсина. Впоследствии 95% доверительные области были подогнаны к ординации с использованием функции ордиэллипс .

В-четвертых, мы проверили влияние обработки фунгицидами и географического района как на состав сообщества, так и на отдельные OTU, используя обобщенные линейные модели (GLM).Сначала была подобрана модель, чтобы проверить влияние географической области, лечения и их взаимодействия. Взаимодействие не было значимым, и модель, включающая поле в качестве фактора блокировки и обработку в качестве фиксированного фактора, могла быть приспособлена для проверки эффекта обработки фунгицидом в обеих областях. Для этих анализов GLM была приспособлена к каждой OTU с использованием функции manyglm в пакете «mvabund» в R (версия 3.8.4; [38]) с использованием отрицательного биномиального распределения вероятностей. Разреженная таблица выборки за OTU была введена в качестве переменной ответа.Затем модели были протестированы с использованием функции и в «mvabund», обеспечивая как многомерный тест для всего сообщества, так и одномерные тесты для каждой OTU. Был использован оценочный тест, и аргумент cor.type был установлен на сжатие, чтобы учесть коррелированный ответ между OTU. P-значения были скорректированы для многократного тестирования. Анализ проводился как на уровне видов, так и на уровне порядка.

Для анализов NMDS, LMM и GLM были включены только 67 таксономически назначенных OTU (представленных как минимум 10 последовательностями во всем мире), поскольку они представляли большинство последовательностей в наборе данных.

Результаты и обсуждение

Качество данных последовательности

В целом, 56% из 454 считываний из пула 420 листьев пшеницы прошли качественную фильтрацию SCATA. Синглтоны составляли 1,7% последовательностей в отфильтрованном наборе данных (471 глобальный синглетон и 324 синглтона на выборку) и были удалены. Удаление синглтонов для каждой выборки привело к потере 30 OTU, представленных 2–5 последовательностями каждая. Также были удалены не грибковые последовательности, которые составили 3,5% от набора данных, в основном последовательности пшеницы.Из каждого образца было удалено 0–45% негрибковых последовательностей. Набор данных с контролем качества содержал 44 245 последовательностей в 42 образцах. Количество последовательностей на образец варьировалось от 197 до 2978, в среднем 1053 последовательности на образец.

Таксономический состав и богатство грибного сообщества листьев пшеницы

Состав грибного сообщества в филлосфере пшеницы был охарактеризован с помощью 454 высокопроизводительного секвенирования. Мы обнаружили 235 грибковых ОТЕ в пуле из 420 листьев пшеницы при кластеризации на 1.Уровень несхожести 5%. Кривые разрежения приближались к насыщению (рис. 2а) для всех условий, а кривые накопления видов — нет (рис. 2б).

Рисунок 2. Кривые разрежения и видонакопления.

a) Кривые разрежения, представляющие взаимосвязь между глубиной секвенирования и видовым богатством в операционных таксономических единицах (OTU). Планки погрешностей указывают 95% доверительный интервал. б) Кривые накопления видов на основе выборки. Когда на поле брали более двух образцов, из каждого поля случайным образом выбирали один обработанный фунгицидом и один необработанный образец для включения в анализ.Планки погрешностей указывают 95% доверительные интервалы, показанные только для северной и южной областей соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111786.g002

Мы таксономически распределили OTU, содержащие более 10 чтений в общем наборе данных (67 OTU, Таблица S3). Эти OTU составляли 90–100% последовательностей в выборках, и ни один из видов в хвосте не присутствовал более чем в 10% выборок. В целом 45% OTU были идентифицированы до уровня вида, а наивысший таксономический уровень идентификации был на уровне порядка.

Сообщество грибов в настоящем исследовании состояло из почти равных пропорций аскомицетов (54%) и базидиомицетов (46%). Наиболее частыми отрядами в наборе данных были Sporidiobolales, Tremellales, Capnodiales и Pleosporales (рис. 3).

Рисунок 3. Состав грибного сообщества на листьях пшеницы на уровне заказов.

Состав сообщества представлен для общего набора данных, обработанных фунгицидами, контрольных и образцов из северной и южной областей соответственно.Заказы с низким содержанием были объединены в группу «Другие» для улучшения визуального представления.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111786.g003

Мы определили «основное» грибковое сообщество из шести ОТЕ, которое было обнаружено во всех обработках и на всех участках. Фактически, эти шесть самых распространенных ОТЕ были обнаружены во всех выборках, кроме двух, включая все поля. Из этих шести дрожжей пять были идентифицированы как базидиомицетные дрожжи (OTU_0_ Sporobolomyces _ roseus , OTU_3_ Dioszegia _ fristingensis , OTU_4_ Cryptococcus_ _ Text _ hungarica ) и один — аскомицет OTU_5_ Cladosporium _spp.Филлосферное грибное сообщество пшеницы часто описывается как состоящее из «розовых» дрожжей ( Sporobolomyces и Rhodotorula , продуцирующих каротиноидные пигменты), «белых» дрожжей ( Cryptococcus ) и сапротрофов аскомицетов, таких как 0006 Cladosporium и 0006 Cladosporium. [17], [18]. Нам удалось подтвердить присутствие этих грибковых таксонов, ранее идентифицированных культурально-зависимыми методами (таблица 2). Сравнение исследований на основе ДНК и культур может дать вводящие в заблуждение результаты, поскольку культурозависимые исследования обычно группируют морфологически похожие виды в одну категорию.Таким образом, сравнение состава грибного сообщества на уровне рода может переоценить сходство с предыдущими исследованиями филлосферы пшеницы. Используя высокопроизводительное секвенирование, мы смогли более подробно описать грибковое сообщество. Blixt et al. (2010) [6] идентифицировали 16 видов грибов из листьев пшеницы в Швеции с помощью клонирования и секвенирования, 13 из них были обнаружены среди 235 OTU в нашем исследовании.

Сообщается, что количество копий ITS варьируется на порядок у разных видов грибов [39], [40] и внутри одного и того же вида грибов [41].Это в некоторой степени приведет к смещению количественных сравнений между различными таксонами. Поэтому мы сосредоточились на сравнении относительной численности каждой OTU в обработанных фунгицидами и необработанных образцах.

Влияние фунгицидов на состав грибного сообщества

Применение фунгицидов оказало значительное влияние на состав грибного сообщества на листьях пшеницы (рис. 4 и таблица 3). Общее содержание ОТЕ было ниже для пула образцов, обработанных фунгицидами (рис. 2). Также наблюдалась тенденция к более низкому среднему содержанию OTU на десять листьев в образцах, обработанных фунгицидами (19.4 ± 1,8 SE), чем в контрольных образцах (24,3 ± 2,1 SE), но разница не была значимой (p> 0,05) (рис. 5а, таблица 4). Не было взаимодействия между обработкой фунгицидами и географическим районом ни по составу сообщества (Таблица 3), ни по богатству ОТЕ (p> 0,05) (Таблица 4). Когда в анализ были включены образцы с полей, инфицированных Puccinia striiformis , наблюдалась та же картина (рис. S3a, таблица S4).

Рисунок 4. Неметрическая многомерная шкала (NMDS) филлосферных грибных сообществ пшеницы.

Порядок сортировки образцов с подобранными переменными окружающей среды. Эллипсы представляют собой 95% доверительные области для южной области (сплошная серая линия), северной области (сплошная черная линия), обработанных фунгицидами (пунктирная серая линия) и контрольных (пунктирная черная линия) групп соответственно. NMDS был выполнен на основе 1000 разреженных наборов данных.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111786.g004

Рисунок 5. Разнообразие операционных таксономических единиц (OTU) и равномерность сообщества.

Коробчатые диаграммы с межквартильными диапазонами а) богатства ОТЕ и б) равномерности сообществ, сгруппированных по обработке (обработанные фунгицидами и контрольные образцы) и географическому району. Горизонтальные линии представляют собой средние значения медианы и точки. Были удалены образцы с полей, зараженных желтой ржавчиной ( Puccinia striiformis ) в южной части (поля 15 и 16, таблица S1).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111786.g005

Обработка фунгицидами отрицательно повлияла на уравновешенность сообщества (p <0.01), и не было взаимодействия с географической областью (p> 0,05) (рис. 5b, таблица 4). Однако картина была иной, когда образцы с полей заражены P . striiformis были включены. Когда были включены эти образцы, наблюдалось значительное взаимодействие между обработкой площади и фунгицидами (p <0,05), и равномерность имела тенденцию быть выше в образцах, обработанных фунгицидами, чем в контрольных образцах в южной части (рис. S3b, таблица S4). П . striiformis доминировал над контрольными образцами в полевых условиях, и, следовательно, однородность этих образцов была очень низкой.Это доминирование могло быть дополнительно усилено из-за патогенной активности P . striiformis , физически изменяя поверхность листа и, таким образом, делая его менее подходящим для других грибов, или на большое количество P . striiformis биомасса, маскирующая менее многочисленных членов сообщества, так как образцы были объединены в эквимолярных количествах [42].

Состав сообщества на уровне заказа значительно различается для обработанных фунгицидами и необработанных образцов (рис.3). Доля Leucosporidiales (p <0,05) и Dothideales (p <0,05) была ниже в образцах, обработанных фунгицидами, чем в контрольных образцах. Это отразилось на уровне видов, где однофакторные тесты показали, что относительная численность трех OTU: OTU_6_ Dioszegia _sp (p <0,05), OTU_28_ Aureobasidium _ пуллуланов _a (p <0,05) и OTU _ Leucospidium_25 _ golubevii (p <0,05), был ниже в листьях, обработанных фунгицидами, чем в контрольных листьях.OTU_6_ Dioszegia _sp был подобен последовательностям ITS обеих D . crocea и D . aurantiaca . Эти виды были изолированы как из филлосферы [43], так и из ризосферы различных растений [44], [45]. Leucosporidium golubevii — дрожжи, обнаруженные в пресной воде [46], о которых сообщалось из филлосферы бальзамического тополя [47]. Кроме того, относительная численность OTU_16_ Phaeosphaeria _ juncophila (p <0.01) была выше в листьях, обработанных фунгицидами (рис. 6). Phaeosphaeria juncophila была впервые выделена из тростника Juncus articulatus , но о ее экологии известно мало.

Рисунок 6. Распределение численности сообществ для наиболее распространенных ОТЕ, сгруппированных по видам обработки.

Коробчатые диаграммы с межквартильными диапазонами, показывающими относительную численность 21 наиболее распространенной оперативной таксономической единицы (OTU) в наборе данных, сгруппированных по обработке. Выбросы не показаны, поэтому OTU_1_ Puccinia _ striiformis исключен.Значимые (p <0,05) различия отмечены звездочкой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111786.g006

Чувствительность филлосферных грибов к фунгицидам в основном изучалась с помощью фунгицидов, которые больше не используются или запрещены в Швеции, за исключением некоторых ингибиторов биосинтеза стеролов ( SBI). Было показано, что фунгициды SBI не оказывают или оказывают умеренное влияние на «розовые» и «белые» филлосферные дрожжи, с несколько более сильным действием на «белые» дрожжи [16]. Aureobasidium pullulans , как сообщается, чувствителен к пропиконазолу [16] и прохлоразу [17], [18], и эти два фунгицида и другие фунгициды SBI использовались почти во всех областях этого исследования (Таблица S1). Аскомицет А . pullulans — один из наиболее распространенных обитателей филлосферы многих сельскохозяйственных культур [48], а также присутствует во многих других местообитаниях [49]. Известно, что Aureobasidium pullulans антагонистичен некротрофным патогенам, например.г. серая гниль у клубники [50] и мучнистая роса у твердых сортов пшеницы [51]. Предполагается, что механизм антагонизма заключается в конкуренции за питательные вещества [52]. Некоторые штаммы А . пуллуланы также производят антибиотик, называемый ауреобазидинами [53]. Антагонистический потенциал агентов биологической борьбы часто зависит от штамма и зависит от механизма антагонизма. Из данных последовательности мы не можем сделать выводы об антагонистической способности OTU. Следовательно, неизвестно, произошло ли снижение относительной численности A . пуллулан в листьях, обработанных фунгицидами, влияет на антагонистическую способность грибкового сообщества.

Несколько OTU были идентифицированы в качестве патогенов мягкой пшеницы в наборе данных: OTU_14_ Mycosphaerella _ graminicola, OTU_13_ Blumeria _ graminis, OTU_1_ Puccinia 0005000500050005000500050005000500050005000500050005Puccinia _ 9000U_Ruccinia _ 9000U Parastagonospora nodorum ), OTU_20_ Monographella _spp и OTU_224_ Pyrenophora _ tritici-repentis .Удивительно, но существенного влияния фунгицидной обработки на относительную численность любой из этих OTU не наблюдалось. Напротив, наблюдалась тенденция к большей изменчивости относительной численности M . graminicola и B . graminis в обработанных образцах (рис.6), а доля B . graminis (единственный представитель Erysiphales) был больше в обработанных образцах (рис. 3). С другой стороны, P . striiformis имел тенденцию доминировать в грибном сообществе в необработанных образцах и почти отсутствовал в обработанных фунгицидами образцах с тех же полей, присутствуя только на двух полях в южной части (рис.3). Устойчивость к фунгицидам обычных патогенов является растущей проблемой и может быть объяснением высокой вариабельности относительной численности патогенов, наблюдаемой здесь. Устойчивость к стробилуринам М . graminicola и тем более в B . graminis широко распространен в странах Северной Европы и Балтии. Кроме того, у обоих патогенов повышается устойчивость к фунгицидам-ингибиторам деметилирования [10]. 454 — это полуколичественный метод, позволяющий только количественно оценить относительную численность различных OTU [25].Таким образом, мы не смогли определить, влияет ли обработка фунгицидами на абсолютное количество патогенов.

Было показано, что в почве ДНК от мертвого мицелия грибов быстро деградирует [54], но данные о скорости деградации ДНК в филлосфере отсутствуют. Возможно, ДНК грибов, убитых фунгицидами, могла быть обнаружена с помощью ПЦР. Поэтому различие в составе сообщества между обработанными фунгицидами и необработанными образцами может быть недооценено.Однако большая разница в относительной численности P. striiformis между обработанными фунгицидами и необработанными образцами не подтверждает эту гипотезу.

Использование фунгицидов значимо коррелировало с изменениями относительной численности определенных таксонов грибов (рис. 6). Можно выдвинуть несколько гипотез, чтобы объяснить причину этих отрицательных или положительных корреляций. Во-первых, разница в чувствительности к фунгицидам [20] может привести к уменьшению количества одних таксонов по сравнению с другими в сообществе.Во-вторых, фунгициды могут воздействовать на конкретный таксон косвенно через изменения численности других, потенциально конкурирующих, членов сообщества. Также возможно, что таксономические группы тесно связаны между собой неизвестными функциональными взаимодействиями, ведущими к попарному совместному возникновению или снижению реакции на другой основной фактор, например, изменения физиологии растений, вызванные фунгицидами [55].

Пространственная изменчивость и биогеографические закономерности

Наблюдались значительные различия между грибными сообществами на листьях пшеницы, взятых из двух разных областей Швеции (рис.4, таблица 3). Эти две области были выбраны, поскольку они различались с точки зрения климатических условий и управления сельским хозяйством. Среднее богатство OTU на десять листьев было значительно ниже (p <0,05) в южной части (13,8 ± 1,1 SE), чем в Северной (26,3 ± 1,6 SE) (рис. 5а, таблица 4), а также общее богатство OTU в пуле образцов (рис. 2), хотя южная часть была представлена ​​только пятью полями. Было больше образцов, обработанных фунгицидами, из Южного региона, но разница в общем содержании OTU сохранялась также при сравнении одинакового количества обработанных фунгицидами и необработанных образцов в двух областях (рис.2б). Выровненность сообществ, как правило, была ниже в южной части (рис. 5b, таблица 4), но не было существенной разницы (p> 0,05), когда в выборках преобладали P . striiformis был удален (рис. S3b, таблица S4).

Различия в составе сообществ между полями были высокими, поскольку поле было значимым фактором в анализе GLM (Таблица 3). Кроме того, большинство OTU (155 из 235) произошло только в одной выборке в наборе данных. Для богатства OTU поле переменных объясняет одну треть случайной вариации, в то время как для равномерности поле не объясняет никаких случайных вариаций (Таблица 4).

На уровне порядка Sporidiobolales имели значительно более высокую относительную численность в Южном районе (p <0,001), в то время как Pleosporales (p <0,01), Helotiales (p <0,05) и неназначенная группа OTU (p <0,05) были относительно более многочисленны в северной части (рис. 3). Было много ОТЕ в Phaeosphariaceae и Pleosporales, которые не соответствовали ни одному из известных видов. Они могут представлять неописанные виды грибов, но также могут отражать внутригеномные вариации, хотя это явление, по-видимому, не является широко распространенным у грибов [56].На уровне видов OTU_16_ Phaeosphaeria _ juncophila (p <0,05) и OTU_18_ Ascochyta _ skagwayensis (p <0,01) были относительно более многочисленными на севере, чем на юге. Грибы рода Ascochyta могут быть слабыми патогенами на злаках или вести сапротрофный образ жизни [57].

OTU_0_ Sporobolomyces _ roseus (p <0,001) был относительно более многочисленным в южной области и был самым большим членом сообщества в этой области, в то время как OTU_3_ Dioszegia _ fristingensis был наиболее распространенным видом в северной части. площадь (рис.7). Оба эти вида продуцируют пигменты и баллистоспоры, два признака, которые считаются признаком адаптации к филлосфере [48]. В нескольких исследованиях сообщается, что Sporobolomyces roseus очень часто встречается на листьях пшеницы [5], [7]. Напротив, Blixt et al . [6] обнаружили лишь небольшую часть этого вида в своем исследовании, но они выборочно собирали листья, пораженные Phaeospharia nodorum . Dioszegia fristingensis был описан относительно недавно в Германии [58] и был зарегистрирован в Китае [59].Было высказано предположение, что группа из Dioszegia , включая D . fristingensis , приурочен к более холодному климату [58].

Рис. 7. Распределение численности сообществ для наиболее распространенных OTU, сгруппированных по географическим районам.

Коробчатые диаграммы с межквартильными диапазонами, показывающими относительную численность 21 наиболее многочисленной оперативной таксономической единицы (OTU) в наборе данных, сгруппированных по географическим районам. Выбросы не показаны, поэтому OTU_1_ Puccinia _ striiformis исключен.Достоверные различия (p <0,05) отмечены звездочкой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111786.g007

Климат — важный фактор, формирующий филлосферные сообщества. В северной части настоящего исследования выпало больше осадков, чем в южной, а относительная влажность была выше за день до отбора проб (таблица 1). Это могло быть возможным объяснением более высокого видового разнообразия грибов, наблюдаемого в северной части. Леветин и Дорси [60] обнаружили, что осадки были наиболее важным фактором для грибов с поверхности листьев, с количеством дрожжей и Phoma spp.положительно коррелируя с количеством осадков в их исследовании. В нашем исследовании несколько дрожжей Cryptococcus и Dioszegia были более многочисленными в северной части, тогда как противоположное было верно для Sporobolomyces roseus (рис. 7).

Атмосфера также является важным источником филлосферных микроорганизмов [61]. Локальная воздушная спора является одним из факторов, влияющих на состав филлосферных сообществ в разных регионах. Леветин и Дорси [60] обнаружили наложение грибов, обнаруженных в филлосфере и в воздушной споре.Точно так же мы определили виды, которые обычно встречаются в воздухе, например Aureobasidium pullulans и Cladosporium spp. [60], [62], [63]. Обнаруженные нами различия между областями и полями указывают на то, что местные условия были важны для состава грибного сообщества и богатства филлосферы пшеницы в этом исследовании.

Выводы

Использование фунгицидов было связано с умеренными, но значительными изменениями в составе грибкового сообщества на листьях пшеницы.Ровность сообщества отрицательно коррелировала с использованием фунгицидов. Фунгициды не влияли на богатство ОТЕ для каждого растения, но в пуле образцов, обработанных фунгицидами, было меньше ОТЕ. На уровне видов относительная численность нескольких сапротрофов существенно изменилась в обработанных фунгицидами пробах. Однако неясно, способны ли сапротрофные виды, сохраняющиеся на обработанных листьях, противостоять и / или разрушать используемые фунгициды, или какую роль они играют в борьбе с патогенами и подавлении болезней.Интересно, что не было значительных различий в относительной численности патогенов мягкой пшеницы, хотя P . striiformis имел тенденцию доминировать в сообществе в контрольных образцах, когда они присутствовали. Необходимы дальнейшие исследования для определения механизмов фунгицидно-грибных взаимодействий в филлосфере сельскохозяйственных культур. Выявление взаимодействий между патогенными и сапротрофными филлосферными грибами и методами управления может помочь в разработке устойчивых стратегий борьбы с болезнями.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Соседнее дерево наиболее распространенных последовательностей ITS2 аскомицетов в наборе данных. Наиболее распространенная последовательность в каждой операционной таксономической единице (OTU_x) включена вместе с общедоступными эталонными последовательностями и выбранными экологическими последовательностями. OTU, отмеченные звездочкой, были таксономически присвоены в SCATA. Коды присоединения гипотез видов в базе данных UNITE приводятся, когда они доступны. Пунктирные линии представляют ветви со значениями начальной загрузки ниже 70%. Sporobolomyces roseus включен в качестве внешней группы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111786.s001

(EPS)

Рисунок S2.

Соседнее дерево наиболее распространенных последовательностей ITS2 базидиомицетов в наборе данных. Наиболее распространенная последовательность в каждой операционной таксономической единице (OTU_x) включена вместе с общедоступными эталонными последовательностями и выбранными экологическими последовательностями. OTU, отмеченные звездочкой, были таксономически присвоены в SCATA.Коды присоединения гипотез видов в базе данных UNITE приводятся, когда они доступны. Пунктирные линии представляют ветви со значениями начальной загрузки ниже 70%. Rhizopus oryzae и Rhizopus microsporus включены, чтобы сформировать внешнюю группу.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111786.s002

(EPS)

Рисунок S3.

Богатство операционных таксономических единиц (OTU) и равномерность сообщества в полном наборе данных. Коробчатые диаграммы с межквартильными диапазонами а) богатства ОТЕ и б) равномерности сообществ, сгруппированных по видам обработки (обработанные фунгицидами и контрольные образцы) и географическим районам.Горизонтальные линии представляют собой средние значения медианы и точки. Также были включены образцы с полей, зараженных желтой ржавчиной ( Puccinia striiformis ) в южной части (поля 15 и 16, таблица S1). F-тесты с аппроксимацией Кенварда-Роджера показали значительное влияние географической области на богатство OTU (p <0,001) и географической области (p <0,01), а также взаимодействие между лечением и территорией (p <0,05) на равномерность сообщества.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111786.s003

(EPS)

Азол-индуцированные углеводные участки клеточной стенки убивают Aspergillus fumigatus

Проявления индуцированной азолом гибели грибов неоднородны

В жизнеспособных клетках митохондрии образуют трубчатые и высокодинамичные сети. Мы выставили A . fumigatus гифы дикого типа, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP), нацеленный на митохондрии, до фунгицидных концентраций вориконазола. Исследование статических изображений образцов, зафиксированных после примерно 12-часового воздействия вориконазола, выявило неоднозначную картину.Некоторые гифы не показали никакого сигнала флуоресценции. Некоторые гифы имеют трубчатую морфологию, другие — сильно фрагментированную митохондриальную морфологию. Иногда мы наблюдали гифы с гомогенной цитозольной флуоресценцией GFP и GFP-положительные везикулы вне гиф. Чтобы понять эту неоднородность, мы проследили судьбу отдельных гиф Aspergillus , подвергшихся воздействию вориконазола, с помощью микроскопии с течением времени. Как показано на рис. 1a – c и дополнительных видеороликах 1–6, мы наблюдали по существу три проявления гибели грибов, вызванной вориконазолом: во-первых, внезапное изгнание цитоплазмы (рис.1а и дополнительные фильмы 1 и 2). Во-вторых, остановка митохондриальной динамики в сочетании с митохондриальной фрагментацией (рис. 1b и дополнительные видеоролики 3 и 4). В-третьих, внутриклеточный лизис митохондрий (рис. 1c и дополнительные видеоролики 5 и 6). Как и ожидалось, вориконазол вызывал значительную и зависящую от концентрации репрессию роста в течение 1 часа после добавления. Однако гифы всегда выживали не менее 2,5–3 ч, независимо от применяемой концентрации азола (дополнительные видеоролики 1–6).Как показано на рис. 1d, частота отдельных проявлений смерти напрямую связана с применяемой концентрацией азола. При более низких концентрациях мы наблюдали в первую очередь выталкивающее высвобождение цитоплазмы, при более высоких концентрациях митохондрии преимущественно лизируют, высвобождая нацеленный на митохондрии GFP в цитозоль (см. Дополнительные фильмы 7–10). Важно отметить, что тщательное изучение фильмов выявило внезапное легкое сокращение гиф непосредственно перед возникновением митохондриальной фрагментации или лизиса (дополнительные фильмы 1–10).Это указывает на нарушение целостности клетки, за которым следует снижение и рассеяние внутриклеточного давления, предшествующее всем трем проявлениям смерти.

Рис. 1

Множественные проявления индуцированной вориконазолом смерти связаны с нарушением целостности клеточной стенки. a d A . fumigatus конидии дикого типа, экспрессирующие митохондриально-направленный GFP, инокулировали в среду Сабуро и инкубировали при 37 ° C. Через 9 ч в среду добавили 0.4 мкг мл -1 ( a ), 1,27 мкг мл -1 ( b , c ) или указанное количество ( d ) вориконазола. За судьбой отдельных гиф следили с течением времени с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. a c Показаны примерные светлопольные и покадровые флуоресцентные изображения GFP (зеленые) оптических стеков, покрывающих целые гифы в фокусе. d Количественный анализ трех проявлений гибели грибов, вызванных вориконазолом.Приблизительно 160 отделов гиф было проанализировано на одно условие в течение 13 часов. Столбцы представляют собой средние значения шести отдельных точек данных, столбцы ошибок указывают стандартные отклонения. Показаны результаты двух независимых экспериментов с покадровой микроскопией для каждого условия. e A . fumigatus конидии, несущие репортер спасения клеточной стенки на основе люциферазы, инокулировали в 96-луночный планшет в среде Сабуро и инкубировали при 37 ° C. Через 7 ч добавляли люциферин и указанное количество вориконазола.Верхняя панель — активность люциферазы во времени после добавления вориконазола. Нижняя панель, типичные микроскопические изображения гиф в темном поле после 17 ч совместной инкубации. Данные представляют из трех независимых экспериментов. f Конидии дикого типа, Δ rho4 и rho4 , экспрессирующие цитозольный GFP, инокулировали в среду Сабуро. После 11 ч инкубации при 37 ° C в среду добавляли 1,27 мкг / мл вориконазола -1 . После 5 ч совместной инкубации гифы окрашивали трипановым синим для гашения сигнала GFP в лизированных компартментах.Определяли процент жизнеспособных микроколоний (график). Точки данных представляют собой средние значения, полосы ошибок указывают стандартные отклонения. Данные представляют шесть независимых слепых экспериментов. Слева показано типичное наложение флуоресцентного изображения оптических стеков, покрывающих частично жизнеспособные гифы дикого типа (зеленый, GFP; красный, трипановый синий). a c , f Столбики имеют размер 10 мкм и применимы ко всем субпанелям

Азол-индуцированный стресс активирует систему спасения клеточной стенки грибов

В A . fumigatus , поддержание целостности клеточной стенки (CWI) зависит от консервативного сигнального пути грибкового стресса (см. Ссылку 15 ). Поскольку данные нашей покадровой микроскопии показали нарушение целостности клеток, мы проанализировали состояние активации этого пути при воздействии A . fumigatus в вориконазол с течением времени. С этой целью мы применили новую репортерную конструкцию, в которой люцифераза светлячка находится под контролем промотора Aspergillus niger agsA , который легко индуцируется системой спасения клеточной стенки при стрессе 16 .Интересно, что репортер сильно индуцировался после двух-трехчасовой лаг-фазы после добавления азола (рис. 1e). В соответствии с нашими предыдущими результатами, концентрация вориконазола не влияла на время начала, но коррелировала с силой индукции. Взятые вместе, это указывает на то, что азолы запускают активацию системы спасения клеточной стенки в то же самое время, когда гифы начинают умирать.

Гифальные перегородки улучшают выживаемость обработанных азолом

Aspergillus гиф

Мы недавно показали, что перегородки гиф необходимы для выживания A . fumigatus , подвергшийся воздействию противогрибковых средств эхинокандина 17 . Эхинокандины подавляют биосинтез углевода клеточной стенки β-1,3-глюкана. Как следствие, стенки клеток гифы иногда разрываются, обрекая пораженный компартмент гифы на смерть. Мы предположили, что перегородки могут иметь аналогичную защитную роль для выживания A . fumigatus гифы, подвергшиеся действию азолов. Гифы дикого типа и мутанта Aspergillus , который не может образовывать перегородки (∆ rho4 ) 18 , а также комплементарный мутант ( rho4 ) подвергались воздействию вориконазола.Чтобы отличить жизнеспособные гифы от мертвых, использовали штаммы, которые конститутивно экспрессируют цитозольный GFP. Через 5 ч гифы окрашивали трипановым синим для гашения сигнала GFP в лизированных компартментах и ​​анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (рис. 1f). В соответствии с нашей гипотезой, количество жизнеспособных микроколоний (определяемых здесь как микроскопические колонии, состоящие из гиф, происходящих из одиночных конидий) мутанта ∆ rho4 было резко снижено по сравнению с мутантом дикого типа и мутантом с дополнением.Примечательно, что количество полностью жизнеспособных микроколоний дикого типа и комплементарного мутанта находилось в том же диапазоне, что и у мутанта ∆ rho4 . Хотя это ясно показывает, что перегородки способствуют выживанию A . fumigatus , зараженный азолами, минимальная концентрация, необходимая для подавления роста мутанта ∆ rho4 , аналогична таковой для мутанта 18 дикого типа. Кроме того, длительное воздействие вориконазола дикого типа (например,> 24 ч) вызывало гибель практически всех микроколоний (не показано).Это демонстрирует, что перегородки гиф могут продлить время выживания, но не предотвратить смерть, вызванную азольными противогрибковыми средствами.

Азолы запускают образование углеводных участков клеточной стенки.

Как показано на фиг. 1f, краситель трипановый синий сильно окрашивал несколько неопределенных пятноподобных структур в мертвых и живых гифах, подвергшихся воздействию вориконазола. Эти структуры не присутствовали в гифах, не подвергавшихся воздействию азолов (дополнительный рис. 1). Только недавно было сообщено, что трипановый синий может маркировать углеводы клеточной стенки хитин и глюкан 19 .Чтобы проверить и в конечном итоге различить эти два потенциальных углевода, мы окрасили гифы, выращенные в аналогичных условиях, хитин-специфическим красителем калькофлуор-белым и глюкан-специфическим красителем анилиновым синим. Оба красителя сильно накапливались в пятнистых структурах, что свидетельствует о том, что они содержат большое количество как хитина, так и глюкана (рис. 2а, б). Интересно, что образование углеводных отложений в клеточной стенке сильно коррелировало с индукцией системы спасения клеточной стенки (рис.2в).

Рис. 2

Ингибирование ланостерин 14α-деметилазы запускает избыточный синтез углеводов клеточной стенки в определенных очагах. a c Конидии A . fumigatus дикого типа, экспрессирующий GFP, нацеленный на митохондрии ( a ), цитозольный GFP ( b ) или без GFP ( c ), инокулировали в среду Сабуро на покровных стеклах и инкубировали при 37 ° C. Эксперимент, изображенный в b , был дополнительно инокулирован конидиями условного мутанта β-1,3-глюкансинтазы в репрессивных условиях ( fks1 tetOn ; контроль окрашивания). a При указании (+ Vori) в среду добавляли 0,4 или 1,27 мкг мл -1 вориконазола через 10 ч после инокуляции. После 15-часовой инкубации гифы фиксировали, окрашивали калькофлюоровым белым и анализировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Представлены репрезентативные изображения оптических стеков митохондрий (GFP; левые панели), хитина (калькофлюоровый белый; средние панели) и наложения (правые панели), которые покрывают всю гифу в фокусе. b После 8 ч инкубации в среду добавляли 1.27 мкг мл -1 вориконазол. После дополнительных 9 ч инкубации при 37 ° C гифы фиксировали, окрашивали анилиновым синим и немедленно анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа. Слева: глюканспецифическая (зеленая) и неспецифическая ( fks1 tetOn ; синий) анилиновая синяя флуоресценция. Справа, светлопольная микроскопия. Стрелки указывают на глюкановые пятна. c После 7 ч инкубации в среду добавляли указанное количество вориконазола. После 2, 3 и 5 ч совместной инкубации образцы фиксировали и окрашивали калькофлюором белым.Процент микроколоний с хитиновыми пятнами был определен с помощью флуоресцентного микроскопа и нанесен на изображенный график. Столбцы представляют собой средние значения указанных точек данных, столбцы ошибок указывают стандартные отклонения. Данные представляют три независимых слепых эксперимента. d Конидии дикого типа, экспрессирующие GFP, нацеленные на митохондрии, окрашивали калькофлуоровым белым либо непосредственно (конидии покоя; левая панель), либо после 45 ч инкубации при 37 ° C в среде Сабуро с добавлением 1.27 мкг мл -1 вориконазол (правая панель). Представлены репрезентативные изображения в светлом поле (слева), изображения поперечных сечений флуоресценции одиночного GFP (в центре слева) и калькофлуорового белого (в центре справа) и их наложение (справа). a , b, и d Полосы представляют собой 5 мкм и применимы ко всем субпанелям

Все эксперименты до сих пор проводились с гифами. Однако сообщалось, что азолы также действуют на конидии A . fumigatus .После воздействия фунгицидных концентраций конидии азола теряют способность к прорастанию 12 . Нам было интересно, могут ли углеводные пятна также наблюдаться в конидиях при обработке азолами, что действительно так, как показано на рис. 2d. В конидиях накапливаются участки с углеводами, которые заполняют до четверти объема конидий. Наконец, конидии погибли так же, как и гифы, подвергшиеся воздействию азола (рис. 2d).

Репрессия фенокопий CYP51, обработанных азолом дикого типа

Несколько противогрибковых активностей, о которых сообщалось для производных азола в более ранних исследованиях, вероятно, не связаны с ингибированием целевого фермента ланостерин 14α-деметилазы 6,11 .Поэтому мы задались вопросом, связаны ли эффекты, которые мы наблюдали в нашем исследовании, с ингибированием ланостерин 14α-деметилазы вориконазолом или представляют собой эффекты, не зависящие от мишени. С этой целью мы сконструировали мутант, который позволил нам специально воздействовать на CYP51-зависимые эффекты путем генетического истощения целевого фермента. А . fumigatus кодирует два функционально избыточных гена CYP51: cyp51A и cyp51B . Для условной репрессии CYP51 был сконструирован мутант, в котором мы заменили эндогенный промотор cyp51A на индуцируемый доксициклином промотор Tet-On и впоследствии удалили cyp51B .Полученный мутант cyp51A tetOn cyp51B не имел явного фенотипа роста по сравнению с диким типом в индуцированных условиях, но был нежизнеспособным в подавленных условиях. Для визуализации морфологии митохондрий условный мутант CYP51 был дополнительно трансформирован конструкцией для экспрессии GFP, нацеленного на митохондрии. Репрессия CYP51 вызвала начальное ингибирование роста, за которым последовали три различных проявления гибели грибов, которые мы также обнаружили после лечения дикого типа вориконазолом: то есть изгнание митохондрий (цитоплазмы) (рис.3a), фрагментация канальцевой митохондриальной сети (рис. 3b) и лизис митохондрий (рис. 3c). Кроме того, мы наблюдали избыточный синтез углеводов клеточной стенки в определенных точках, очень похожий на накопление хитина и глюкана, наблюдаемое при воздействии вориконазола дикого типа (рис. 3d). Это ясно демонстрирует, что описанные выше эффекты вориконазола объясняются исключительно ингибированием ланостерин 14α-деметилазы.

Рис. 3

Азол-триггерная гибель клеток и синтез углеводных участков клеточной стенки связаны с ингибированием ланостерин 14α-деметилазы. a d Конидии условного cyp51A tetOn cyp51B штамма ( a d ) и дикого типа ( d ), которые экспрессируют митохондрии GFP, которые экспрессируют митохондрии GFP. в индуцированных условиях в среде Сабуро с добавлением 15 мкг / мл доксициклина -1 . После 9 ч инкубации при 37 ° С гифы переводили в репрессивные условия путем замены среды без доксициклина. a c За судьбой отдельных гиф следили с течением времени с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.Представлены иллюстративные светлопольные и покадровые флуоресцентные изображения GFP (зеленые) оптических стеков, покрывающих целые гифы в фокусе. d После 5 ч инкубации в репрессивных условиях гифы фиксировали, окрашивали калькофлуоровым белым и подвергали конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Изображенные изображения представляют собой оптические стеки флуоресценции GFP (левые панели), калько-флуоресцентной белой флуоресценции (средние панели) и наложение (правые панели), которые покрывают всю гифу в фокусе. a d Полосы представляют собой 10 мкм и применимы ко всем субпанелям

Углеводные пятна клеточной стенки инвагинируют плазматическую мембрану

Микроскопическое исследование гиф и конидий, подвергшихся воздействию вориконазола, подвергшихся воздействию хитина и глюкана, позволило предположить локализацию пятна внутри гиф или конидий.Это может означать, что либо нерегулярный синтез клеточной стенки происходит в секреторных везикулах, нагруженных хитином и глюкансинтазой, в цитоплазме 20 , либо избыточный синтез происходит на определенных участках поверхности клетки, тем самым заставляя плазматическую мембрану проникать в тело гифы. Чтобы прояснить точную топологию отложений хитина и глюкана, мы экспрессировали GFP-тегированный датчик напряжения клеточной стенки Wsc1 в A . fumigatus . Этот трансмембранный белок типа I равномерно распределяется на плазматической мембране при нормальных условиях роста 18 .Покадровая микроскопия гиф, экспрессирующих Wsc1-GFP, обработанных вориконазолом, продемонстрировала образование замечательных инвагинаций плазматической мембраны размером до 3 мкм. Эти инвагинации локализованы совместно с сайтами, где формируются углеводные пятна клеточной стенки (Fig. 4 and Supplementary Movies 11-13). Интересно, что интенсивность флуоресценции Wsc1-GFP значительно увеличивается на участках инвагинированных мембран (тепловая карта флуоресценции, Fig. 4). Очень похожие результаты были получены и с другим датчиком напряжения клеточной стенки, меченным GFP (MidA-GFP) 18 .Это демонстрирует, что транспортные везикулы, загруженные сенсорами стресса и, предположительно, другими мембранными белками, непрерывно доставляются к участкам избыточного биогенеза клеточной стенки при азольном стрессе.

Рис. 4

Множественные азол-индуцированные углеводные участки клеточной стенки инвагинируют плазматическую мембрану. А . fumigatus конидии, экспрессирующие нацеленный на митохондрии красный флуоресцентный белок (RFP), и GFP-меченый мембранно-заякоренный Wsc1 инокулировали в среду Сабуро.После 9 ч инкубации при 37 ° C в среду добавляли 0,53 мкг / мл вориконазола -1 . Флуоресценцию анализировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. На микрофотографиях показано светлое поле (слева), сечения флуоресценции (зеленый, RFP; схема темного свечения, GFP) и наложение двух сечений флуоресценции репрезентативной гифы, инкубированной в течение 4 ч в присутствии вориконазола. Интенсивность флуоресценции GFP дополнительно визуализируется с помощью цветовой схемы тепловой карты (правая микрофотография), накопление Wsc1-GFP в местах инвагинаций плазматической мембраны указано стрелками.Полоса представляет собой 5 мкм

Ослабленная фунгицидная активность у мутантов дыхательной цепи

Результаты покадровой микроскопии показали, что фунгистатический эффект азолов опережает фунгицидную активность на несколько часов. Это предполагает, что фунгицидная активность представляет собой дискретный эффект, который проявляется параллельно или строится поверх фунгистатической активности. Мы и другие недавно сообщили о связи между дисфункцией митохондрий и чувствительностью к азолам A . fumigatus 21,22 . В ходе этих исследований мы сконструировали мутанты, пораженные митохондриальным дыхательным путем. В частности, мы заменили эндогенные промоторы rip1 (AFUA_5G10610), гена, кодирующего белок железо-сера Риеске, каталитическую субъединицу митохондриального комплекса III, и cycA , гена, кодирующего цитохром C, на индуцируемый доксициклином Промоутер Tet-On. Хотя А . fumigatus строго зависит от функциональной дыхательной цепи, эти мутанты жизнеспособны в подавленных условиях благодаря альтернативной оксидазе.Этот фермент может катализировать перенос электронов от восстановленного убихинона непосредственно к кислороду и тем самым обходит комплекс III и IV 23 . Оба условных мутанта, cycA tetOn и rip1 tetOn , проявляли неожиданный и удивительный фенотип в подавленных условиях (фиг. 5). Нарушение комплекса III, а также подавление активности цитохрома С привело к минимальному росту гиф Aspergillus в зонах ингибирования вориконазола Etest (рис.5а). Это резко контрастирует с циклом дикого типа или с cycA tetOn и rip1 tetOn в индуцированных условиях, когда конидии погибают, а зоны ингибирования Etests обычно лишены какого-либо роста гиф (рис. . 5a, сравните Рис. 2d). В то же время макроскопическое исследование планшетов показало минимальную ингибирующую концентрацию для cycA tetOn и rip1 tetOn в репрессированных условиях, аналогичных или даже ниже, чем у дикого типа (рис.5а). Очень похожие результаты были получены при использовании метода микроразбавления бульона (рис. 5б, в). Эти результаты показывают, что вориконазол проявляет общую фунгистатическую активность против A . fumigatus независимо от митохондриальной цепи переноса электронов. Напротив, фунгицидная активность, по-видимому, зависит от функциональности обычной митохондриальной цепи переноса электронов и, таким образом, может быть четко отделена от фунгистатической активности вориконазола.

Фиг.5

Фунгицидная активность азолов зависит от функциональности обычной митохондриальной цепи переноса электронов. a 1 × 10 6 конидий дикого типа (wt) и условного цитохрома c ( cycA tetOn ) и комплекса III ( rip1 tetOn ) мутантов были распространены на Чашки с агаром Сабуро. Если указано, в среду дополнительно добавляли 15 мкг / мл доксициклина -1 для индукции условного промотора (+ Doxy).Наносили полоски Voriconazole Etest, и планшеты инкубировали при 37 ° C. Репрезентативные фотографии были сделаны примерно через 48 часов. На панелях рядом с фотографиями макроскопических полос Etest показаны увеличенные фрагменты в рамке. b , c Конидии указанных штаммов инокулировали в среду Сабуро с добавлением резазурина (маркер жизнеспособности клеток, 0,1 мкг / мл -1 ) и указанного количества вориконазола и инкубировали при 37 ° C. Макроскопические ( b ) и микроскопические ( c ) изображения были получены через 42 ч.

Фунгицидная активность азолов связана с образованием пятен

Потеря целостности клетки после интенсивных инвагинаций плазматической мембраны предполагает, что образование Углеводные пластыри клеточной стенки ответственны за фунгицидную активность азольных противогрибковых средств.Поэтому мы задались вопросом, коррелирует ли сдвиг противогрибковой активности азолов с фунгицидной на фунгистатическую, наблюдаемый с условными мутантами, пораженными цитохромным респираторным путем, с образованием пятен на клеточной стенке. Как показано на рис. 6, дело обстоит именно так. Мутанты cycA tetOn и rip1 tetOn в подавленных условиях не показали углеводных пятен при концентрациях, при которых пятна уже наблюдаются у дикого типа (0.4, 0,8 и 1,6 мкг / мл -1 вориконазола, рис. 6). В этих концентрациях вориконазол уже проявляет фунгистатическую активность против cycA tetOn и rip1 tetOn в подавленных условиях. Более высокие концентрации азола (3,2 и 6,4 мкг / мл -1 вориконазола) приводили к значительному образованию пятен, что также коррелировало с постепенным ингибированием минимального роста мицелия (фиг. 5c и 6).

Фиг.6

Фунгистатические концентрации азола не вызывают образования углеводных пятен на клеточной стенке у мутантов, затронутых традиционной митохондриальной цепью транспорта электронов. a c Конидии дикого типа (wt; a ), cycA tetOn ( b ) и ript1 tetOn

354 c Сабуро и инкубируют при 37 ° C. После 10 ч инкубации при 37 ° C в среду добавляли указанное количество вориконазола.После дополнительных 10 ч инкубации гифы окрашивали калькофлюоровым белым, фиксировали и анализировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Представлены репрезентативные изображения оптических стеков калькофлюоровой белой флуоресценции (хитина), которые покрывают гифы в фокусе. На нижних панелях показаны увеличенные изображения участков в рамке на верхних панелях. Полосы представляют собой 50 мкм и применимы ко всем соответствующим субпанелям.

Мы использовали разделение фунгистатической и фунгицидной активности вориконазола, наблюдаемое с rip1 tetOn и cycA tetOn , чтобы исследовать мутантное отношение образования пятен и гибели грибковых клеток.Гифы условных мутантов, экспрессирующих GFP, нацеленный на митохондрии, культивировали в подавленных условиях, а затем подвергали воздействию концентраций азола, которые индуцируют образование участков клеточной стенки. После совместной инкубации с азолом гифы окрашивали калькофлуоровым белым для визуализации углеводных пятен, а затем анализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Жизнеспособные компартменты гиф были идентифицированы на основе их трубчатой ​​и динамической митохондриальной морфологии (рис. 7a и дополнительные видеоролики 14 и 15).В зависимости от концентрации азола, большое количество компартментов гиф оставалось живым после приблизительно 15-17 часов воздействия азола. Количественный анализ гиф выявил значительную и сильную корреляцию гибели грибковых клеток с наличием и размером углеводных участков клеточной стенки (Рис. 7b-d и Дополнительный Рис. 2). Примечательно, что особенно при более низких концентрациях, которые в целом были менее фунгицидными по отношению к мутантам в подавленных условиях, мы наблюдали небольшое количество компартментов (<4%), которые были мертвыми, но не имели пятен (дополнительный рис.2). Это предполагает, что незначительная фунгицидная активность азолов может существовать независимо от фунгицидного эффекта образования углеводных участков клеточной стенки. Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что образование пятен на клеточной стенке сильно коррелирует с фунгицидной активностью азолов, в то время как фунгистатические концентрации азолов не обязательно приводят к образованию пятен.

Рис. 7

Наличие и размер углеводного участка клеточной стенки коррелируют с гибелью отдельных гиф. a d Конидии мутанта условного комплекса III ( rip1 tetOn ), экспрессирующие GFP, нацеленные на митохондрии, инокулировали в среду Сабуро в репрессированных условиях. После 10 часов инкубации при 37 ° C в среду добавляли 2,4 мкг мл -1 вориконазола и инкубировали еще 15 часов. Гифы окрашивали калькофлюором белым и анализировали с помощью покадровой лазерной сканирующей микроскопии. a Репрезентативные изображения мертвых и живых гиф.Слева: калькофлуор-белая флуоресценция (пятна), справа — флуоресценция GFP (митохондрии). Мертвые гифы (стрелки) характеризовались множественными углеводными участками клеточной стенки, остановкой митохондриальной динамики (см. Дополнительный фильм 7), фрагментацией канальцевой митохондриальной сети и угасанием флуоресценции GFP. Живые гифы демонстрируют высокодинамичные и трубчатые митохондрии (сравните Дополнительный фильм 7) и меньше или совсем не содержат углеводных участков клеточной стенки. Полоса показывает 50 мкм. b c Были взяты короткие покадровые последовательности нескольких гиф, и каждый компартмент гиф был проанализирован на жизнеспособность, длину компартмента и совокупный диаметр содержащих углеводных участков клеточной стенки.Изображенные результаты основаны на данных покадровой микроскопии, полученных в трех технических повторностях в одном эксперименте. Всего было проанализировано двести девяносто четыре отдела гиф. Очень похожие результаты были получены в двух независимых экспериментах со штаммом cycA tetOn в аналогичных условиях (дополнительный рисунок 1). b Абсолютные и относительные числа живых и мертвых отсеков, в которых есть пятна или нет. Значительное количество жилых отсеков не имеют пятен, в то время как почти все мертвые отсеки имеют участки. c Графики показывают совокупный диаметр пластыря и длину отсека для каждого живого (синий) и мертвого (красный) отсека. d Мертвые отсеки демонстрируют значительно более высокое соотношение совокупного диаметра пластыря и длины отсека (индекс пятна; изображен в виде графика в виде квадратов и усов). Статистическая значимость (*** p ≤ 0,001) была рассчитана с помощью теста Манна-Уитни.

Ингибирование синтеза глюкана задерживает фунгицидную активность

Мы предположили, что ингибирование образования этих пятен будет противодействовать фунгицидной активности вориконазола.Как показано на фиг. 8a, ингибирование β-1,3-глюкансинтазы Fks1 эхинокандином каспофунгином изменяет микроскопический вид окрашенных калькофтором белыми углеводных участков клеточной стенки, которые образуются в обработанных азолом A . fumigatus гифы. Пятна стали намного меньше и компактнее по сравнению с довольно большими аморфными телами под воздействием только азола.

Рис. 8

Ингибирование синтеза β-1,3-глюкана ослабляет фунгицидную активность вориконазола. a , b Конидии A . fumigatus дикого типа ( a ) или GFP дикого типа, экспрессирующего нацеленный на митохондрии ( b ), инокулировали в среду Сабуро на покровных стеклах ( a ) или на восьмилуночном предметном стекле для микроскопии живых клеток ( b ) и инкубировали при 37 ° C. После 9 ч инкубации в среду добавляли 1,27 мкг мл -1 вориконазола (Vori) и, если указано, через 30 минут дополнительно добавляли 4 мкг мл -1 каспофунгина (+ Caspo). a После 4-часовой совместной инкубации с противогрибковыми средствами гифы фиксировали, окрашивали калькофлюором белым и анализировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Представлены репрезентативные калько-флуоресцентные белые флуоресцентные изображения оптических стеков, которые покрывают всю гифу в фокусе. Полоса представляет собой 10 мкм и применима к обеим субпанелям. b После 5- и 6-часовой совместной инкубации с противогрибковыми препаратами морфология и динамика митохондрий, по меньшей мере, 975 компартментов гиф на одно состояние были проанализированы с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа в семи независимых экспериментах.График в виде квадратов и усов показывает процент жизнеспособных компартментов при каждом условии. Статистическая значимость (** p <0,01) была рассчитана с помощью двустороннего парного критерия Стьюдента t (предполагая равные дисперсии). c Конидии условного мутанта β-1,3-глюкансинтазы ( fks1 tetOn ) инокулировали в среду Сабуро в 24-луночные планшеты и инкубировали при 37 ° C в репрессивных условиях в течение 11 часов. Когда указано, медиа были впоследствии дополнены 1.27 мкг мл -1 вориконазола (Vori) или дополнительно 10 мкг мл -1 доксициклина (Vori + Doxy) для индукции экспрессии β-1,3-глюкансинтазы Fks1. После дополнительных 6 ч инкубации при 37 ° C среду отбрасывали. Лунки промывали и дополняли свежей средой без противогрибковых средств и доксициклина, и планшеты инкубировали дополнительно от 10 до 30 часов при 37 ° C. Процент выживших микроколоний определяли под микроскопом и отображали на изображенном графике в виде прямоугольников и усов.Критериями жизнеспособности были продолжение роста в сочетании с преломлением света; жизнеспособные гифы были яркими, а мертвые — темными. Примерное яркое изображение мертвых и жизнеспособных микроколоний, оцененных по истечении указанного дополнительного времени инкубации, показано справа, мертвые микроколонии обозначены стрелками. Изображенные экспериментальные результаты представляют четыре независимых слепых эксперимента в аналогичных условиях. Статистическая значимость (*** p ≤ 0.001) был рассчитан с помощью двустороннего непарного (предполагая равные дисперсии) теста Стьюдента t -тест

Таким образом, мы проанализировали влияние ингибирования β-1,3-глюкансинтазы на выживаемость обработанных азолом A . fumigatus гифы. Каспофунгин был способен значительно увеличивать количество жизнеспособных компартментов гиф после пяти и 6-часовой совместной инкубации с вориконазолом (рис. 8b). Очень похожие результаты были получены при использовании условного мутанта fks1 ( fks1 tetOn 17 ).Условная репрессия гена β-1,3-глюкансинтазы fks1 способна значительно увеличить количество микроколоний, выживших после 6-часового воздействия вориконазола (рис. 8c). Эти данные показывают, что ингибирование накопления пятен на клеточной стенке задерживает фунгицидные эффекты вориконазола.

Клинические изоляты, устойчивые к азолам, не образуют участков клеточной стенки.

Противогрибковые препараты на основе азола в настоящее время рекомендуются в качестве терапии первой линии при инвазивном аспергиллезе и других грибковых инфекциях.К сожалению, недавнее появление устойчивости к азолам у грибковых патогенов ставит под вопрос этот подход и инфекции, вызванные устойчивостью к азолам A . fumigatus приводит к смертности до 88% 24,25 . Если, как показывают наши данные, пятна на клеточной стенке связаны с фунгицидной активностью азолов, они должны отсутствовать в изолятах, устойчивых к азолам. Чтобы проверить эту гипотезу, из Национального справочного центра по инвазивным грибковым инфекциям были приобретены три клинических изолята, чувствительных к азолам, и два устойчивых к азолам.Как показано на фиг. 9, три клинических изолята, чувствительных к азолам, в равной степени образовывали множественные участки клеточной стенки при низких ингибирующих концентрациях вориконазола (0,8 мкг / мл -1 ). Точно так же пятна были обнаружены после воздействия высоких концентраций азола (12,8 мкг / мл -1 ). В отличие от этого, клинические изоляты, устойчивые к азолам, не образовывали пятен после воздействия какой-либо из тестируемых концентраций азола. Это ясно показывает, что, во-первых, образование пятен также запускается в различных изолятах Aspergillus азолами, а во-вторых, образование пятен связано с чувствительностью к азолам.

Рис. 9

Азолы запускают образование пятен у чувствительных к азолам, но не у устойчивых к азолам A . fumigatus клинических изолята. Конидии трех чувствительных к азолам (2017–323, 2017–350, 2017–351) и двух азолустойчивых (2014–065, 2016–364) клинических изолятов A . fumigatus инокулировали в среду Сабуро. После 10 ч инкубации при 37 ° C в среду добавляли указанное количество вориконазола. После дополнительных 10 ч инкубации гифы окрашивали калькофлюоровым белым, фиксировали и анализировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.Представлены репрезентативные изображения оптических стеков калькофлюоровой белой флуоресценции (хитина), которые покрывают гифы в фокусе. Правые панели показывают увеличенные изображения секций в рамке на панелях, показанных слева. Столбики размером 50 мкм применимы ко всем соответствующим субпанелям.

Опасности, связанные с фунгицидами | Home Guides

Фунгицид — это тип пестицида, который используется для уничтожения грибковых патогенов на растениях. Вирусы, нематоды и бактерии также вызывают болезни растений, но грибки — номер один.1 причина потери урожая во всем мире по данным Американского фитопатологического общества. Хотя фунгициды обладают очевидными преимуществами в защите растений, они также таят в себе некоторые потенциальные скрытые опасности.

Фитотоксичность

Одним из побочных эффектов фунгицидов является фитотоксичность или токсическое действие на полезные растения. Важно использовать правильный тип фунгицида на правильном растении в нужное время, иначе у вас могут возникнуть проблемы. Например, фунгицид азоксистробин, часто используемый для обработки винограда, может убить некоторые сорта яблок, в то время как трифлоксистробин вреден для определенных сортов винограда, но не для других.Некоторые фунгициды специфичны для роста, например фунгициды триазол + QoI, которые нельзя применять для соевых бобов после стадии роста, известной как R5.

Устойчивость

Со временем виды грибов могут стать устойчивыми к химическим веществам, содержащимся в фунгицидах, и более высокие дозы или более частое применение фунгицидов могут оказаться неэффективными. Во всем мире сопротивление проявляется у все большего числа патогенов полевых культур, фруктов, овощей, орехов, декоративных растений и газона. Кроме того, когда у растений развивается устойчивость к общему биохимическому маркеру фунгицида, они становятся устойчивыми ко всем другим продуктам того же химического семейства.

Здоровье человека

Некоторые фунгициды могут вызывать раздражение кожи и глаз, а другие могут вызывать раздражение горла и кашель при вдыхании. Продолжительное вдыхание некоторых фунгицидов, таких как зирам, может вызвать нервные и зрительные расстройства. Долгосрочные эффекты фунгицидов на человека до сих пор неизвестны. Исследование, опубликованное в журнале Lancet Infectious Diseases в 2009 году, показало, что использование фунгицидов в сельском хозяйстве может способствовать устойчивости к лекарствам у людей с опасными для жизни инфекциями легких, вызванными грибком aspergillus.Другое исследование, опубликованное в Proceedings of the National Academy of Sciences в 2007 году, показало, что фунгициды могут навсегда заставить замолчать или перепрограммировать нормальные гены, которые могут сохраняться в течение нескольких поколений.

Экологические аспекты

Согласно исследованию 2012 года, опубликованному в Ecology Letters, фунгицид хлороталонил — наиболее часто используемый синтетический фунгицид в Соединенных Штатах — токсичен для водных животных, таких как головастики, устрицы и рыбы, при воздействии химикатов. -выкл от растений загрязняет близлежащие воды или грунтовые воды.Группа грибов, в которую входит сульфат меди, токсична для пчел, а дикие птицы и домашний скот были отравлены семенами сельскохозяйственных культур, обработанными фунгицидами на основе ртути.

Альтернативы

В некоторых случаях органические фунгициды могут быть более безопасной альтернативой синтетическим фунгицидам. Общие источники включают серу, медь, растительные масла и бикарбонаты. Однако даже медь может вызывать раздражение кожи, глаз, дыхательных путей и пищеварительного тракта, тогда как сера может вызывать дерматит и диарею.Чтобы безопасно использовать любой фунгицид, проконсультируйтесь с местным агентом по расширению или специалистом по питомнику, чтобы диагностировать проблему и выбрать лучшее лечение. Всегда читайте этикетки на продуктах и ​​точно следуйте инструкциям.

Ссылки

Биография писателя

Бонни Синглтон профессионально пишет с 1996 года. Она писала для различных газет и журналов, включая «Вашингтон Таймс» и «Женский мир». Она также писала для новостного журнала BBC-TV «Из Вашингтона» и более десяти лет работала на канале Discovery Channel в Интернете.Синглтон имеет степень магистра музыковедения в Университете штата Флорида и является членом Американской ассоциации независимых писателей.

Фунгицидное действие на микоризу | LebanonTurf

Влияние фунгицидов на микоризы

При использовании инокулянтов против микоризных грибов важно учитывать, какой эффект окажут ваши фунгициды. Нет смысла делать прививку микоризными грибами только для того, чтобы убить их фунгицидами.Возникает очевидный вопрос: «Можно ли вообще применять фунгициды при использовании инокулянтов против микоризных грибов?»

Микоризные грибы могут быть довольно чувствительны к некоторым фунгицидам, но не ко всем. Некоторые фунгициды действительно могут стимулировать микоризные грибы, в то время как другие фунгициды губительны. Компания ROOTS составила следующие списки фунгицидов, в отношении которых существуют опубликованные данные об их влиянии на микоризные грибы. Кроме того, на основе полевых испытаний ROOTS составил несколько хороших общих правил использования фунгицидов.Эти правила представлены здесь:

Общие правила использования фунгицидов с инокулянтами микоризных грибов

  1. Как правило, внекорневое внесение несистемных фунгицидов очень мало влияет на микоризные грибы, которые обитают на корнях. Даже если некоторые фунгициды попадают в почву, их количество, достигающее корневой зоны, обычно слишком мало, чтобы оказывать значительное долгосрочное воздействие на микоризные грибы.
  2. Обработка почвы несистемными фунгицидами может нанести вред микоризным грибам, если применяется до того, как произойдет колонизация корней.Поэтому важно избегать использования фунгицидов слишком близко ко времени инокуляции.
  3. После того, как споры полностью колонизировали корни, микоризные грибы становятся менее чувствительными к вредным, но несистемным фунгицидам, вносимым путем увлажнения почвы, потому что:
    1. Уровни фунгицидов будут высокими в почве, но, как правило, значительно ниже в тканях корней.
    2. Высокий уровень фунгицидов в почве может убить грибковую ткань в почве, но не грибковую ткань, внедренную внутри корня.
    3. Когда уровни фунгицидов в почве снижаются из-за выщелачивания или постепенного разложения, грибковая ткань внутри корня вырастает новую поглощающую сеть в почву, чтобы восстановить микоризный эффект.
  4. Внекорневая или почвенная обработка системных фунгицидов может привести к накоплению фунгицида в ткани корня, оказывая отрицательное воздействие на микоризные грибы. Корни обработанных растений не подвержены колонизации микоризными грибами в течение до 3 недель после обработки системными фунгицидами.

Краткое описание использования фунгицидов с микоризными грибами

  1. Некорневые несистемные фунгициды обычно можно использовать в любое время.
  2. Избегайте использования фунгицидов для полива почвы слишком близко ко времени инокуляции, за 2 недели до инокуляции (дольше, если она носит системный характер) и через 4 недели после инокуляции.

Специфические эффекты фунгицидов из опубликованной литературы

ROOTS составил следующие списки фунгицидов, по которым существуют опубликованные данные об их влиянии на микоризные грибы.Конечно, никто не смог протестировать какой-либо фунгицид против всех видов микоризных грибов, поэтому при составлении этих списков были сделаны некоторые основные предположения:

  1. Для этого списка фунгицид считался ингибирующим, если сообщалось, что он ингибирует, независимо от других противоречивых отчетов.
  2. Две основные группы микоризных грибов, ВАМ и Экто-, рассматриваются отдельно, поскольку фунгициды, вредные для одной группы, не обязательно должны быть вредными для другой.

Подавляющее действие фунгицидов на ВАМ (эндомикоризные грибы)

Фунгициды без ингибирующего действия:
Карбамат (Фербам, Фермат)
Карбендазим (Бавистан)
Хлоронеб (Терсан, Демосан)
Хлороталонил (Браво, Даконил-2787, Дифонил, Экзотерм)
Дифонилатан,
Дифолиматан,
Дифолиматан (С) Манкозеб (Дитан М-45, Манзат; Фор)
Манат (Дитан М-22, Манеб)
Роврал (Chipco-26019)
Тиабендазол (Мертект)
Тирам (Терсан 75, Арасан)

Фунгициды с ингибирующим действием:
* Aliette (Fosetyl-Al) *
Беномил (Benlate, Tersan-1991)
Captan (Ортоцид)
Сульфат оксихлорида меди (CDCS)
Формалин (формальдегид-металоксамил)
Subdue, Ridomil) *
PCNB (Terrachlor, Tri-PCNB)
Phaltan (Folpet; Thiophal)
Terrazole (Truban, ETMT)
Tilt (CGA-65250, Banner, Propiconazol)
Thiophanate Methyl (Cleary 3336) )
Vitavax (карбоксин, DCMO)
Стробилурины, такие как азоксистробин (Abound, Dynasty, Heritage, Protégé, Quadris, Quilt, Soyard, Uniform)
Kresoxim-methy (Cygnus, Sovran)
Fenpropimorph (фунгистатический эффект) (фунгистатический эффект) )
Топсин-М (Easout, Fungo, Duosan)


* Есть несколько опубликованных отчетов, указывающих, что эти (*) фунгициды действительно стимулировали развитие ВАМ.(См. Примечания ниже.)
ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибирование происходит при орошении почвы, а не при опрыскивании листвы.

Ингибирующее действие фунгицидов на эктомикоризу

Фунгициды, не обладающие ингибирующим действием:
Aliette (Fosetyl-Al)
Беномил (Бенлат, Терсан-1991) ниже 100 мкг / г
Каптан (Ортоцид) ниже 100 мкг / г
Карбамат (Фермат, Фербам)
Карбендазим (Фунабендазим) T)
Dexon
Dichlofluanid (Euparen 50WP)
Difolatan (Sulfonimide, Difosan, Captafol)
Fuberidazole
Metalaxyl (Subdue, Ridomil)
Prpoamocarb (Banol, Prevex, Previconehanplant) File, Tattoo 3336; Топсин M70)
Тирам (Арасан) ниже 100 мкг / г

Фунгициды с ингибирующим эффектом:
Banrot
Хлороталонил (Даконил-2787, Браво)
Манкозеб (Дитан)
ПХНБ (Терраклор, Три-ПХНБ)
Триадимексон (Бейлетон)
Зинолахлатерам
Ипродион (Роврал, Чипко 26019)

Банкноты

  • Для этого списка фунгицид считается ингибирующим, если существует опубликованный отчет, документирующий ингибирование, независимо от других противоречивых отчетов.
  • В этом списке считается, что фунгицид не оказывает вредного воздействия, независимо от того, не оказал ли он никакого эффекта или оказал положительное влияние на развитие микоризы.
  • Часто одно и то же фунгицидное химическое вещество имеет много разных торговых наименований. Могут быть другие имена, не показанные здесь.
  • Ни один фунгицид не уничтожает микоризу; они только замедляют развитие на короткое время после нанесения. Время этого эффекта зависит от продолжительности, в течение которой химическое вещество сохраняется в окружающей среде.
  • Большинство фунгицидов для опрыскивания листьев при правильном применении (за исключением системных, таких как Бейлтон) не влияют на микоризу, потому что фунгицид не контактирует с микоризами в почве (в значительных количествах).

Прочие пестициды

  • Нет сообщений о каких-либо инсектицидах или гербицидах, применяемых в указанных количествах и влияющих на развитие микоризы.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.