Пцр количественный гепатит в: Вирусный гепатит В (HBV), количественный

Содержание

Вирусный гепатит В (HBV), количественный

Вирусный гепатит В (HBV), количественный- исследование для выявления возбудителя гепатита B (HBV), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) определяется наличие генетического материала (ДНК) вируса и его количество (вирусная нагрузка) в образце крови. Вирусный гепатит В (ВГВ) – инфекционное заболевание печени, вызванное ДНК-содержащим вирусом гепатита В (HBV). Среди всех причин развития острого гепатита и хронической вирусной инфекции вирус гепатита В считается одной из самых распространенных в мире. Полимеразная цепная реакция отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Методом ПЦР можно определить ДНК вируса качественно или количественно. Количественное определение вирусной нагрузки позволяет оценить интенсивность развития болезни, эффективность проводимой терапии или развитие устойчивости к противовирусным препаратам.

Существует зависимость между концентрацией вируса в крови и исходом острого вирусного гепатита В. При низком уровне виремии вероятность перехода инфекции в хроническую форму близка к нулю, а инфицированный человек неопасен для окружающих. При высокой вирусной нагрузке (< 105 копий/мл) хронизация возникает часто и больной является потенциальным источником инфекции. Эффективность противовирусной терапии оценивается по уменьшению количества ДНК вируса в крови. Через 3-6 месяцев после начала лечения вирусная нагрузка при адекватном терапевтическом ответе должна уменьшиться на 1-2 порядка. Отсутствие уменьшения количества вируса или его увеличение на фоне проводимого лечения требует пересмотра и изменения терапии. Количественное определение ДНК вируса гепатита В совместно с клинической картиной заболевания и биохимическими показателями, маркерами инфекции, а также результатом пункционной биопсии печени позволяет дать прогноз заболевания и оценить необходимость противовирусной терапии. 7 МЕ/мл).

На результаты могут влиять

загрязнение биоматериала;

наличие в образце ингибиторов – химических и белковых субстанций, влияющих на различные компоненты ПЦР;

присутствие в крови гепарина.

Уровень вирусной нагрузки крови не указывает на степень повреждения печени и тяжесть заболевания. Для их оценки необходимо исследовать биохимические показатели и материалы биопсии.

Количественное определение ДНК вируса гепатита В является обязательным исследованием до назначения противовирусной терапии. Во время курса лечения анализ необходимо повторить через 3-6 месяцев.

Вирусный гепатит В нередко сочетается с вирусным гепатитом D.

Назначается в комплексе с

HBsAg

anti-HBc, антитела

anti-HBe, антитела

anti-HBs, антитела

HBеAg

HBV, ДНК [ПЦР качественный]

anti-HDV, антитела

Anti-HCV, антитела, ИФА

Биохимический анализ крови при заболеваниях ЖКТ

Коагулограмма базовая

Вирус гепатита В (Hepatitis B Virus), количественное определение ДНК, ПЦР (ДНК HBV, колич.)

Линейный диапазон измерения: 150-100 000 000 МЕ/мл.

Концентрация ДНК ВГВ (вирусная нагрузка) — один из лабораторных показателей для определения стадии хронического гепатита В и критерий эффективности противовирусной терапии, для этого исследование проводится до начала и в процессе противовирусного лечения.

Результаты лабораторных исследований при различных вариантах инфекции, вызванной ВГВ*
Маркер	HBsAg	anti-Bs	anti-Bc IgG	anti-Bc IgM	HBeAg	anti-Be	ДНК ВГВ
ОГВ	+	—	-/+	+	+/-	-/+	+
Перенесенный ГВ	—	+	+	—	—	+	—
Иммунитет после вакцинации	—	+	—	—	—	—	—
Фаза иммунной толерантности	+	—	+	—	+	—	+++
ХГВ, HBeAg-позитивный	+	—	+	—	+	—	++
ХГВ, HBeAg-негативный	+	—	+	—	—	+	+
Носи-тельство ВГВ	+	—	+	—	—	+	+/-
Латентная ВГВ-инфекция	—	—	+/-	—	—	—	+/-

* Клинические рекомендации Российской гастроэнтерологической ассоциации и Российского общества по изучению печени по диагностике и лечению взрослых больных гепатитом В, 2014.

Обращаем Ваше внимание на то, что интерпретация результатов исследований, установление диагноза, а также назначение лечения, в соответствии с Федеральным законом № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21 ноября 2011 года, должны производиться врачом соответствующей специализации.

Сдать ДНК HBV, копий/мл (PCR real time) анализ во Владимире

Описание

Диагностика инфекционных заболеваний (ПЦР) — ДНК HBV, копий/мл (PCR real time)

Сроки исполнения: 5-7 рабочих дней*.
Биоматериал: кровь.

Описание:

Подготовка к исследованию: специальной подготовки не требуется
Справка: количественное определение ДНК HBV – тест, позволяющий выявить количество ДНК вируса гепатита B в организме человека с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции). Метод основан на определении фрагмента ДНК вируса, которому присуща уникальная последовательность нуклеотидов, характерная только для данного вируса, и больше ни для какого другого. Данный метод является крайне важным для диагностики HBV-инфекции, поскольку в популяции вируса гепатита B встречается достаточно мутантных штаммов (HbsAg и HBеAg-негативных), которые не улавливаются обычными серологическими тестами. Количественное определение ДНК HBV позволяет оценить активность протекающего процесса, что необходимо для назначения рационального лечения и оценки его эффективности. Специфичность этого теста составляет 98%.
Гепатит B (ВГВ, HВV) острое вирусное заболевание, характеризующееся поражением печени и различными внепеченочными проявлениями. Протекает остро или хронически, в желтушной (35%) или безжелтушной (65%) формах. Вирус гепатита В чрезвычайно устойчив во внешней среде (к УФ-лучам, температуре, детергентам), передается с кровью и биологическими жидкостями (парентеральным, трансплацентарным, половым и бытовым путями).
Инкубационный период инфекции составляет в среднем 50 дней, но может растягиваться до 6 месяцев. В конце инкубационного периода повышаются уровни печеночных трансаминаз (АЛАТ и АСАТ), увеличиваются печень и селезенка, возможно повышение концентрации билирубина в 2-3 раза. Встречаются гриппоподобный, артралгический, диспептический или смешанный варианты клинического течения продромального периода.
Острый период (2 — 12 дней) протекает с интоксикационным синдромом: снижением аппетита, диспепсией, инверсией сна. В трети случаев возникает желтуха: резко повышается уровень билирубина, слизистые оболочки и кожа окрашиваются в различные оттенки желтого цвета, появляется кожный зуд. Наиболее опасным симптомом является снижение протромбинового индекса и альбумина крови, свидетельствующие о печеночно-клеточной недостаточности. Бурный гуморальный иммунный ответ зачастую приводит к появлению иммунных комплексов, оседающих на эндотелии сосудов почек, щитовидной железы и других органов, что сопровождается развитием васкулитов. В клинике системных проявлений HBV-инфекции могут возникать аутоиммунный тиреоидит, хронический гастрит, синдром Шегрена, идеопатическая тромбоцитопеническая пурпура, узелковый периартериит, гломерулонефрит, ревматоидный артрит и другие патологические состояния.
Фаза выздоровления характеризуется исчезновением признаков холестаза, нормализацией процессов обмена веществ, восстановлением функции печени, на первый план выходят системные проявления заболевания. По сравнению с другими вирусными гепатитами, гепатит В имеет более системный характер, менее благоприятно протекает у детей. Хроническое течение возникает в 5% случаев. «Здоровые» носители HbsAg, также как и больные хроническим гепатитом В, подвержены высокому риску развития цирроза печени и гепато-целлюлярной карциномы. Системные проявления заболевания не всегда исчезают вместе с излечением гепатита В.
Показания к назначению: Положительный качественный тест на наличие ДНК вируса гепатита B в сыворотке крови, определение тактики лечения пациентов, точная оценка эффективности терапии.
Единицы измерения: копий/мл
Нормальные показатели: вирус не обнаружен («отрицательно»)
Интерпретация результатов:
ДНК вируса определяется в крови больного в случае активного размножения вируса гепатита. Количественное определение ДНК вируса проводится поле положительного ответа на качественное определение ДНК HBV. Количественная характеристика содержания ДНК вируса гепатита важна для оценки эффективности противовирусной терапии и имеет прогностическое значение для определения хронизации гепатита B: при исходно низком уровне виремии процент хронизации острого гепатита B близок к нулю, а при высоком уровне виремии у пациента острый гепатит B чаще всего переходит в хронический. Снижение концентрации ДНК вируса гепатита B в течение недели от начала терапии на 85% является быстрым и точным параметром для предсказания эффективности терапии. Если же снижения концентрации ДНК вируса не наблюдается или оно небольшое, тогда следует пересмотреть тактику лечения.
Внимание! Интерпретировать результат количественного определения ДНК вируса гепатита B должен только врач соответствующей квалификации.

Анализ на гепатит В

Гепатит B (ВГВ, HВV) – острое инфекционное заболевание, вызываемое ДНК-содержащим вирусом HBV с преимущественно парентеральным механизмом характеризующееся в клинически выраженных случаях симптомами острого поражения печени и интоксикацией (с желтухой и без нее) и протекающее с выраженным полиморфизмом клинических проявлений болезни и исходов от выздоровления до возможности развития хронического гепатита В, цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Вирус гепатита В содержит ДНК и чрезвычайно устойчив во внешней среде (к УФ-лучам, температуре, детергентам).

Гепатит В является антропонозом. Источниками инфекции при гепатите B являются больные с различными формами данного заболевания. Вирус у инфицированных лиц содержится в крови, сперме, вагинальном секрете. Механизм инфицирования – гемоконтактный (парентеральный). Пути инфицирования: естественные (половой, бытовой, перинатальный) и искусственные, связанные с парентеральными вмешательствами. Восприимчивость к ВГВ – всеобщая, обусловленная наличием специфических рецепторов к HBs антигену на гепатоцитах.

Ведущее эпидемиологическое значение при парентеральных гепатитах имеют искусственные пути передачи возбудителя, которые реализуются при проведении немедицинских и медицинских манипуляций, сопровождающихся повреждением кожи или слизистых оболочек, а также манипуляций, связанных с риском их повреждения.

Инфицирование вирусами парентеральных гепатитов при немедицинских манипуляциях, сопровождающихся повреждением кожи или слизистых оболочек, происходит при инъекционном введении наркотических средств (наибольший риск 80-100%), нанесении татуировок, пирсинге, ритуальных обрядах, проведении косметических, маникюрных, педикюрных и других процедур с использованием контаминированных инструментов.

Группу повышенного риска составляют медицинские работники, пациенты, нуждающиеся в гемодиализе или переливаниях крови, заключенные, члены семей HBs-положительных лиц, новорожденные от HBs-положительных матерей.

В жизнедеятельности вируса гепатита В различают две фазы: фазу репликации и фазу интеграции.

В фазе репликации происходит воспроизведение (размножение) вируса. ДНК вируса проникает в ядро гепатоцита, где с помощью ДНК-полимеразы синтезируется нуклеокапсид, содержащий ДНК вируса, антигены HBcAg, HBeAg, которые являются основной мишенью иммунной системы. Затем нуклеокапсид мигрирует из ядра в цитоплазму, где реплицируются белки внешней оболочки (HBsAg), и, таким образом, происходит сборка полного вириона. При этом избыток HBsAg, не использованный для сборки вируса, через межклеточное пространство попадает в кровь. Полная сборка (репликация) вируса заканчивается презентацией его растворимого нуклеокапсидного антигена – HBeAg на мембране гепатоцита, где происходит его «узнавание» иммуноцитами. Антиген HBcAg находится в печеночной клетке, серологическими методами не определяется, потому что отсутствует в крови в свободном виде. Определяется наличие в крови антител (anti-HBc) к этому антигену, вырабатывающихся вследствие его высокой иммуногенности.

В фазе интеграции происходит интегрирование (встраивание) фрагмента вируса гепатита В, несущего ген HBsAg, в геном (ДНК) гепатоцита с последующим образованием преимущественно HBsAg. При этом репликация вируса прекращается, однако генетический аппарат гепатоцита продолжает синтезировать HBsAg в большом количестве. Вирусная ДНК может быть интегрирована не только в гепатоциты, но и в клетки поджелудочной железы, слюнных желез, лейкоциты, сперматозоиды, клетки почек. Фаза интеграции сопровождается становлением клинико-морфологической ремиссии. В этой фазе в большинстве случаев формируется состояние иммунологической толерантности к вирусу, что приводит к купированию активности процесса и носительству HBsAg. Интеграция делает вирус недосягаемым для иммунного контроля.

Длительность инкубационного периода составляет от 1-4 до 6 месяцев, в среднем – 80 дней. Гепатит В протекает циклически, с различной степенью тяжести: легкая, средняя и тяжелая.

Преджелтушный период длится 8-12 дней и более. Болезнь начинается постепенно. Характерны астеновегетативный (слабость, утомляемость, разбитость) и диспепсический (снижение аппетита, тошнота, иногда рвота, горечь во рту, тяжесть и тупые боли в правом подреберье) синдромы. Часты головная боль, нарушение сна. Примерно у 20-30% больных наблюдают боли в крупных суставах, уртикарную сыпь, реже кожный зуд. В конце преджелтушного периода увеличивается печень (иногда селезенка), появляются темная моча и ахоличный кал. При лабораторном обследовании в моче обнаруживают уробилиноген, иногда желчные пигменты. В крови повышается активность АЛТ и АСТ, обнаруживается ДНК вируса и специфические маркёры HBV-инфекции (HBsAg, HBeAg, анти-HBcIgM). Преджелтушный период может отсутствовать, тогда потемнение мочи и желтушность склер служат первыми симптомами болезни.

Желтушный период. С появлением желтухи самочувствие больных ухудшается: нарастает слабость, снижается аппетит вплоть до анорексии, тошнота, сухость и горечь во рту, нередко – головная боль и головокружение, прекращаются артралгии. В желтушном периоде ещё более увеличивается печень. Постепенно нарастает желтуха, достигая максимума на 2-3 неделе. Моча становится тёмной, кал на высоте желтухи становится ахоличным. Продолжительность желтушного периода варьирует от нескольких дней до нескольких недель, чаще составляет 2-6 недель. Повышение активности АЛТ в 30-50 раз регистрируют в течение всего желтушного периода. Белково-синтетическая функция печени при ВГВ нарушается при тяжёлом течении болезни

(снижение содержания альбумина, протромбинового индекса). В периферической крови обнаруживают тенденцию к лейкопении и лимфоцитозу, СОЭ снижается или в норме.

Период реконвалесценции может продолжаться до 6 месяцев. Клинико-биохимические изменения исчезают медленно: содержание билирубина в сыворотке нормализуется в течение 2-4 недель; повышенная активность ферментов сохраняется от 1 до 3 мес. У ряда больных можно наблюдать волнообразный характер гиперферментемии в период реконвалесценции. Рецидив заболевания с клинико-ферментативным обострением и гипербилирубинемией требует исключения HDV-гепатита.

Возможны субклиническая и инаппарантная формы (отсутствие жалоб и клинических проявлений, но выявление специфических маркеров гепатита В при повышенном уровне или нормальном уровне АЛТ).

Верификация диагноза гепатита В основана на выявление специфических серологических маркеров и ДНК вируса. Рекомендуется проведение определения ДНК вируса гепатита В методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) качественно и количественно пациентам с подозрением на острым вирусным гепатитом В для ранней диагностики установления уровня вирусной нагрузки. ПЦР позволяет выявить ДНК вируса в сыворотке крови, лимфоцитах, что указывает на репликацию. ДНК ВГВ начинает обнаруживаться в крови в среднем через месяц после инфицирования и является первым диагностическим маркером ВГВ, опережая появление HBsAg на 10-20 дней. Исследование на ДНК ВГВ позволяет проводить раннюю диагностику ОГВ, выявлять скрытые (латентные) формы ГВ и мутантные по HBeAg штаммы вируса. Количественное определение ДНК ВГВ позволяет судить о вирусологическом ответе при лечении.

Положительный результат ПЦР за период более 6 месяцев указывает на хроническую инфекцию. Определение вирусной нагрузки (количество ДНК вируса в крови) позволяет оценить вероятность перехода заболевания в хроническую форму. Повышенные уровни печеночных трансаминаз при положительном результате ПЦР являются показателями необходимости проведения терапии. Во время лечения вирусного гепатита В исчезновение ДНК вируса свидетельствует об эффективности лечения.

Показания к назначению:

диагностика острого гепатита В;

выявление стертых, инаппарантных форм гепатита В;

диагностика гепатитов смешанной этиологии — выявление ведущего вируса;

определение стадии активной репликации вируса при хроническом течении гепатита В;

контроль эффективности проводимой терапии.

Референсные значения: не обнаружено (отрицательный результат).

Необходимо воздержаться от приема пищи в течение 2-3 часов.

Вирус гепатита С, определение РНК (количественное)

Исследуемый материал
Цельная кровь (с ЭДТА)

Метод определения
ПЦР.

Вирусный гепатит С (HCV) – инфекционная болезнь, которая поражает печень. Инфицирование происходит через кровь.

Данный вирус имеет способность мутировать, и это дает ему возможность ускользать от иммунной системы, что затрудняет лечение. На самом деле, вирус гепатита С представляет собой спектр подобных вирусов, они выделяются в отдельные подгруппы, которые квалифицируются по субтипам и генотипам.

Для выявления возбудителя HCV применяется анализ рнк вируса гепатита C, в ходе которого методом ПЦР (полимерной цепной реакции) в реальном времени определяют наличие РНК (генетического материала) вируса, его количество, то есть вирусную нагрузку в образце крови.

Существуют следующие виды тестов крови на определение рнк гепатита C:

количественный,

качественный.

Количественный тест

Количественный анализ на гепатит С определяет концентрацию вируса в крови. РНК гепатит С количественно проверяет степень инфекционности заболевания. При повышении концентрации гепатита в крови возрастает риск заразить другого человека. Кроме того, высокое содержание вируса уменьшает эффект лечения.

ПЦР количественный на гепатит С важен для контроля эффективности терапии, расшифровка анализа имеет прогностическое значение, позволяющее определять хронизацию гепатита В. В большинстве случаев ПЦР С-гепатита делают сразу же после обнаружения соответствующих антител. Далее тесты проводят на четвертую, двенадцатую, двадцать четвертую недели. Потом – раз в год.

Качественный тест

РНК вируса гепатита С качественное исследование должны проходить все пациенты с антителами С-гепатита. Результат анализа дает два ответа – обнаружен вирус или нет. Референсное значение, то есть норма, — это отрицательный показатель. По положительному результату судят об активном размножении данного вируса, заражающего здоровые клетки печени.

Беременность и гепатит С

Гепатит С не может быть противопоказанием к беременности, хотя передача вируса плоду возможна. Риск такого заражения не зависит от времени инфицирования матери. В течение беременности женщинам трижды проводится обследование на HCV. Часто инфекция протекает бессимптомно и не влияет на исход беременности и родов.

Лаборатория ИНВИТРО предлагает вам провести все необходимые исследования. Материалом для сдачи данного анализа является венозная кровь (более информативный материал для исследования – биопсия печени). Взятие крови производится натощак. У нас приемлемые цены и всегда качественное выполнение работы.

HCV, РНК количественно [реал-тайм ПЦР]

Исследование для выявления возбудителя гепатита C (HCV), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) определяется наличие генетического материала (РНК) вируса и его количество (вирусная нагрузка) в образце крови.

РНК HCV может быть обнаружена в концентрации, находящейся за нижней границей линейного диапазона концентраций. Линейный диапазон концентраций – это диапазон, в котором можно точно посчитать количество копий возбудителя. Для данного анализа линейный диапазон концентраций ДНК HCV, определяемых детектирующим амплификатором, составляет 7,5×102 – 1,0×108копий/мл образца.

Услуги по взятию (сбору) биоматериала

Венозная кровь

Срок выполнения

до 2 суток

Синонимы русские

Вирус гепатита С (ВГС), количественное определение РНК.

Синонимы английские

Hepatitis C Virus RNA, Quantitative, Real-Time PCR, Blood, HCV Viral Load, Hepatitis C Virus RNA Quant.

Метод исследования

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до сдачи крови.

Общая информация об исследовании

Вирус гепатита С (HCV) – РНК-содержащий вирус из семейства Flaviviridae, который поражает печень. Он способен размножаться в клетках крови (нейтрофилах, моноцитах и макрофагах, В-лимфоцитах) и вызывать криоглобулинемию, болезнь Шегрена и В-клеточные лимфопролиферативные заболевания. HCV благодаря высокой мутационной активности способен избегать воздействия защитных механизмов иммунной системы. Существует 6 генотипов и множество субтипов вируса, которые имеют разные значения для прогноза развития заболевания и эффективности противовирусной терапии.

Основной путь передачи инфекции – через кровь (препараты для переливания элементов крови и плазмы, донорские органы, нестерильные шприцы, иглы, инструменты для татуирования, пирсинга). Вероятно заражение при половом контакте и ребенка от матери во время родов, но это случается нечасто.

Острый вирусный гепатит, как правило, характеризуется бессимптомным течением и остается невыявленным в большинстве случаев. Только у 15 % инфицированных заболевание протекает остро – с тошнотой, ломотой в теле, отсутствием аппетита и потерей веса (редко сопровождается желтухой). У 60-85 % инфицированных развивается хроническая инфекция, что в 15 раз превышает частоту хронизации при гепатите В. Хронический вирусный гепатит С протекает с повышением печеночных ферментов и скудным проявлением симптомов. У 20-30 % больных заболевание приводит к циррозу печени, увеличивая риск развития печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциномы.

Выявление РНК HCV свидетельствует о размножении вируса в организме и является методом диагностики заболевания. Генетический материал вируса можно обнаружить с помощью ПЦР через 10-12 дней после инфицирования – в этот период специфические антитела, которые образуются через несколько месяцев после заражения, отсутствуют и биохимические показатели функции печени находятся в пределах референсных значений.

Посредством ПЦР выявляют РНК вируса качественно или количественно. Благодаря качественному методу подтверждается присутствие вируса гепатита С и его активное размножение. 7 МЕ/мл).

Что может влиять на результат?

Недостоверный результат может быть получен при:

загрязнении биоматериала;

наличии в образце ингибиторов – химических и белковых субстанций, влияющих на различные компоненты ПЦР;

присутствии в крови гепарина.

Важные замечания

Уровень вирусной нагрузки крови не указывает на степень повреждения печени и тяжесть заболевания. Для их оценки необходимо исследовать биохимические показатели и материалы биопсии.

При планировании лечения очень важно определить генотип вируса гепатита С.

Также рекомендуется

Кто назначает исследование?

Инфекционист, гепатолог.

Тип биоматериала и способы взятия

Тип

На дому

В Центре

Самостоятельно

Венозная кровь

да

На дому: возможно взятие биоматериала сотрудником мобильной службы.

В Диагностическом центре: взятие, либо самостоятельный сбор биоматериала осуществляется в Диагностическом центре.

Самостоятельно: сбор биоматериала осуществляется самим пациентом (моча, кал, мокрота и т.п.). Другой вариант – образцы биоматериала предоставляет пациенту врач (например, операционный материал, ликвор, биоптаты и т. п.). После получения образцов пациент может как самостоятельно доставить их в Диагностический центр, так и вызвать мобильную службу на дом для передачи их в лабораторию.

Литература

Возианова Ж.И. Инфекционные и паразитарные болезни: В 3х т. — К.: Здоровье, 2000. – Т.1.: 600-690.

Кишкун А.А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике. — М.:ООО МИА, 2006. – 471-476 с.

Harrison’s Principles of Internal Medicine. 16th ed. NY: McGraw-Hill; 2005: 1822-1855.

Lerat H, Rumin S, Habersetzer F, and others. In vivo tropism of hepatitis C virus genomic sequences in hematopoietic cells: influence of viral load, viral genotype, and cell phenotype. Blood. 1998 May 15;91(10):3841-9.PMID:9573022.

Revie D, Salahuddin SZ. Human cell types important for hepatitis C virus replication in vivo and in vitro: old assertions and current evidence. Virol J. 2011 Jul 11;8:346. doi: 10.1186/1743-422X-8-346. PMID:21745397.

Количественное определение ДНК ВГB | Биомедика

Синонимы: ДНК вируса гепатита В количественный метод (HBV DNA, HВV – qPCR), определение вирусной нагрузки ВГВ.

Связанные тесты: серологические исследования маркеров вирусного гепатита В, биллирубин, АЛАТ, АСАТ, ГГТП.

Количественное выявление ДНК ВГВ является основным методом определения интенсивности репликации вируса гепатита В, отражающей активность вирусной инфекции. Человек с определяемым уровнем вирусной нагрузки несет потенциальную опасность передачи вируса гепатита В.

Исследование позволит вашему врачу:

в совокупности с результатами других исследований определить активность ВГВ – инфекции;
определить необходимость назначения противовирусной терапии;
оценивать эффективность проводимой терапии;
проводить мониторинг хронического вирусного гепатита В;
проводить контроль рецидива инфекции.

Исследование рекомендуется проводить при:

положительных результатах серологических маркеров вирусного гепатита В;
положительных результатах качественного определения ДНК вируса гепатита В;
HBsAg – негативной инфекции;
хроническом вирусном гепатите В.

Метод:

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени.

Чувствительность:

Не менее 50 МЕ/мл.

Линейный диапазон:

От 1 000 МЕ/мл до 100 000 000 МЕ/мл.

Материал для исследования:

Плазма крови.

Подготовка к исследованию

Исследование рекомендуется проводить натощак; между последним приёмом пищи и взятием крови должно пройти не менее 6 часов.

Особые условия:

Предварительная запись не требуется.

Формат выдачи результата:

Количество вируса в 1 мл плазмы крови (МЕ/мл, копий/мл).

Комментарий:

Обнаружение ДНК вируса в крови свидетельствует о присутствии вируса в организме.

Для количественного определения ДНК вируса гепатита В в реальном времени могут потребоваться две разные мишени | Virology Journal

LOD дуплексного анализа ПЦР в реальном времени

Тест на чувствительность, который проводился с использованием 20 повторов различных концентраций (10 ⁴, 10 ³, 100, 50, 20, 10, 5, 2,5 МЕ / мл), показал, что самая низкая 100% положительная концентрация для дуплексного анализа ПЦР в реальном времени составляла 20 МЕ / мл (таблица 3). Эти результаты были дополнительно подвергнуты пробит-регрессионному анализу.Пределы детализации S-области, C-области и дуплексного ПЦР в реальном времени составили 15,2 МЕ / мл (95% доверительный интервал, 12,2–23,4 МЕ / мл), 16,6 МЕ / мл (95% доверительный интервал, 12,9– 26,1 МЕ / мл) и 11,9 МЕ / мл (95% доверительный интервал, 9,2–19,8 МЕ / мл) соответственно.

Таблица 3 Предел обнаружения областей S и C с использованием дуплексного анализа ПЦР в реальном времени

Специфичность

Все 50 HBV-отрицательных образцов были определены с помощью дуплексной ПЦР в реальном времени как отрицательные на ДНК HBV, демонстрирующие 100% специфичность.

Линейность

Десятикратные разведения образцов генотипа B использовали для теста линейности дуплексной ПЦР в реальном времени. Результаты показали хорошую корреляцию. Уравнения линейной регрессии для областей S и C: Y = -3,39X + 45,39 (R ² = 99,9%) и Y = -3,43X + 43,93 (R ² = 99,5%), соответственно (рис. ).

Рис.1

Кривые амплификации для областей S и C с использованием дуплексного анализа ПЦР в реальном времени с разбавленными образцами HBV с высоким титром (от 2.0 × 10 ⁸ до 2,0 × 10 ¹ МЕ / мл)

Сравнение вирусных нагрузок, определенных с помощью дуплексного анализа ПЦР в реальном времени с анализом CTM, v2

Количественно было отобрано 104 образца HBV, которые были собраны из 302 военного госпиталя, и 75 образцов HBV, взятых из банков крови в Китае. анализировали с помощью дуплексного ПЦР в реальном времени. Вирусные нагрузки большинства образцов HBV были одинаковыми для анализа CTM v2.0 и дуплексного анализа (рис.2). Однако было обнаружено 11 образцов с вирусной нагрузкой, определенной с помощью дуплексного анализа, которая была на 1,0 log выше, чем определенная с помощью диагностического набора Roche. В то же время образцы из банков крови имели аналогичные результаты для анализа CTM, v2.0 и дуплексного анализа в реальном времени (таблица 4).

Рис. 2

Корреляционный анализ и анализ Бланда-Альтмана количественных результатов дуплексного анализа ПЦР в реальном времени, Roche CAP / CTM v2 и анализа Даана ПЦР в реальном времени. a и b анализ количественных результатов дуплексного анализа ПЦР в реальном времени и Roche CAP / CTM v2 с 104 образцами HBV, собранными из 302 военного госпиталя Китая. c и d анализ количественных результатов дуплексного анализа ПЦР в реальном времени и Roche CAP / CTM v2 с 75 образцами HBV, собранными из банков крови в Китае. e и f Анализ количественных результатов дуплексной ПЦР в реальном времени и ПЦР в реальном времени Daan с 59 образцами HBV, собранными из больницы ChaoYang в Китае

Таблица 4 Образцы пациентов, которые показали существенно разные результаты количественного анализа ДНК с использованием набора Roche, набора Daan и дуплексного анализа ПЦР в реальном времени

Сравнение вирусной нагрузки дуплексного анализа ПЦР в реальном времени с анализами ПЦР в реальном времени Daan

Всего 59 образцов HBV, которые были собраны из больницы ChaoYang, были количественно проанализированы с помощью набора Daan и дуплексного анализа ПЦР в реальном времени .Результаты вирусной нагрузки ДНК HBV сравнивали с использованием корреляционного анализа и анализа Бланда-Альтмана. Этот анализ выявил статистическую корреляцию между результатами набора Daan и дуплексной ПЦР в реальном времени (R ² = 0,923, p <0,0001). Между ними наблюдалась средняя разница 0,22 ± 0,67 log ₁₀ МЕ / мл (пределы согласия: от -1,08 до 1,53 log ₁₀ МЕ / мл) (рис. 2). Среди 59 образцов вирусная нагрузка 3 образцов была определена с помощью дуплексной ПЦР в реальном времени и равнялась 1.0 log ₁₀ выше, чем результаты набора Daan, с разницей 1,34, 1,36 и 1,41 log ₁₀ (Таблица 4).

Сравнение вирусной нагрузки, определенной с использованием областей S и C, с дуплексным анализом ПЦР в реальном времени

Всего было проанализировано 238 образцов HBV, которые были собраны из 302 военного госпиталя, госпиталя Чаоянг и банков крови в Китае. с помощью дуплексной ПЦР в реальном времени. Уровни ДНК HBV дополнительно анализировали в соответствии с областями S и C для дуплексной ПЦР в реальном времени.Эти результаты выявили статистическую корреляцию между результатами из регионов S и C (R ² = 9657, p <0,0001). Средняя разница составляет -0,18 ± 0,40 log ₁₀ МЕ / мл (пределы согласия: от -0,96 до 0,60 log ₁₀ МЕ / мл). Среди 238 образцов HBV результаты для 8 образцов для области S были более чем на 1,0 log ₁₀ МЕ / мл выше, чем для области C с использованием дуплексной ПЦР в реальном времени (рис. 3).

Рис. 3

Корреляционный и мягкий-альтернативный анализ количественных результатов S- и C-областей дуплексных ПЦР в реальном времени в 238 образцах HBV. a : Корреляционный анализ количественных результатов S- и C-областей дуплексных ПЦР в реальном времени в 238 образцах HBV. b : Анализ мягкого и альтмана количественных результатов S и C областей дуплексных ПЦР в реальном времени в 238 образцах HBV

Выравнивание последовательностей и вариабельность образцов, для которых количественные результаты S-области были более чем на 1.0 log

₁₀ выше, чем C-области

Среди восьми образцов с количественными результатами с использованием S-области с дуплексной ПЦР в реальном времени больше чем на 1.0 log ₁₀ МЕ / мл, чем результаты с использованием области C, шесть образцов были успешно амплифицированы и секвенированы. Мутации произошли в прямом и обратном праймерах в четырех образцах; однако не было мутаций в области праймера / зонда в других двух образцах, только мутации в области амплификации вне последовательности праймера / зонда (фиг. 4).

Рис. 4

Выравнивание праймеров C-области с использованием дуплексного ПЦР-анализа в реальном времени с последовательностями образцов, у которых количественные результаты ДНК для C-области были больше единицы. 0log ₁₀ МЕ / мл ниже, чем для области S

Выравнивание последовательностей и вариабельность образцов, для которых количественные результаты с помощью дуплексной ПЦР в реальном времени были более чем на 1,0 log

₁₀ выше, чем результаты, полученные с помощью набора Roche

Среди 11 образцов с количественными результатами, полученными с помощью набора Roche, ниже более чем на 1,0 log ₁₀ МЕ / мл, чем при использовании дуплексной ПЦР в реальном времени, полноразмерные области или области pre-Core и Core только четырех образцов были успешно амплифицированы и секвенированы.Еще четыре образца с аналогичными результатами с использованием набора Roche и дуплексной ПЦР в реальном времени были амплифицированы и секвенированы в качестве контрольных последовательностей. После выравнивания мы обнаружили несколько различных сайтов в области 1827–1970 нуклеотидов, которая является целевой областью набора Roche. Различные сайты в четырех образцах перечислены в таблице 5.

Таблица 5 Мутации в образцах, которые дали более низкие количественные результаты ДНК (по крайней мере, 1,0 log ₁₀ МЕ / мл) с помощью набора Roche, чем с дуплексной ПЦР в реальном времени. проба

Проверка с использованием плазмид

Последовательности четырех образцов с количественными результатами с использованием дуплексного анализа ПЦР в реальном времени больше более чем на 1.0 log ₁₀ МЕ / мл, чем результаты с использованием набора Roche, были клонированы в вектор Т и секвенированы. Последовательности других четырех образцов с аналогичными результатами для набора Roche и дуплексной ПЦР в реальном времени также были клонированы в вектор Т. Концентрации всех плазмид были измерены и преобразованы в копии / мл и МЕ / мл. Плазмиды в концентрации 1,0 ⁴ МЕ / мл были количественно детектированы с помощью дуплексной ПЦР в реальном времени и Daan PCR в реальном времени. Количественные результаты показали, что в двух из четырех образцов результаты были ниже более чем на 1.0 log ₁₀ МЕ / мл по сравнению с другими анализами (таблица 6).

Таблица 6 Проверка плазмид, содержащих последовательности ДНК HBV образцов с более высокой вирусной нагрузкой (не менее 1,0 log ₁₀ МЕ / мл), обнаруженных с помощью набора Roche, была на 1,0 log ₁₀ МЕ / мл ниже, чем у дуплексных реальных анализ ПЦР-раз

Оценка эффективности TRUPCR® HBV Анализ ПЦР в реальном времени для количественного определения ДНК вируса гепатита B в клинических образцах: отчет центра третичной медицинской помощи по лечению печени

Абе А., Иноуэ К., Танака Т., Като Дж., Кадзияма Н., Кавагути Р., Танака С., Йошиба М., Кохара М. Количественное определение геномной ДНК вируса гепатита В с помощью детектирующей ПЦР в реальном времени. J Clin Microbiol. 1999; 37: 2899–903.

CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar

Бизли РП. Вирус гепатита В. Основная этиология гепатоцеллюлярной карциномы. Рак. 1988; 61: 1942–56.

Артикул
CAS

Google Scholar

Chan HL, Tsang SW, Liew CT, Tse CH, Wong ML, Ching JY, Leung NW, Tam JS, Sung JJ. Генотип вируса и уровни ДНК вируса гепатита В коррелируют с гистологическим повреждением печени при HBeAg-отрицательной хронической вирусной инфекции гепатита В. Am J Gastroenterol. 2002; 97: 406–12.

Артикул
CAS
PubMed

Google Scholar

Ciotti M, Marcuccilli F, Guenci T, Prignano MG, Perno CF. Оценка анализа Abbott Real Time HBV DNA и сравнение с анализом Cobas AmpliPrep / Cobas TaqMan 48 при наблюдении за пациентами с хроническими случаями гепатита B.J Clin Microbiol. 2008; 46: 1517–9.

Артикул
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar

ВОЗ, Руководство по тестированию на гепатиты В и С, февраль 2017 г. ISBN 978-92-4-154998-1

Исмаил А.М., Сивакумар Дж., Анантарам Р., Дайалан С., Самуэль П., Флетчер Дж. , и другие. Рабочие характеристики и сравнение систем реального времени Abbott и artus для количественного определения ДНК вируса гепатита В. J Clin Microbiol.2011; 49 (2011): 3215–21.

Артикул
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar

Ли WM. Инфекция, вызванная вирусом гепатита В. N Engl J Med. 1997; 337: 1733–45.

Артикул
CAS
PubMed

Google Scholar

Liaw YF, Tai DI, Chu CM, Chen TJ. Развитие цирроза печени у пациентов с хроническим гепатитом B: проспективное исследование. Гепатология.1988. 8: 493–6.

Артикул
CAS
PubMed

Google Scholar

Лю CJ, Chen PJ, Lai MY, Lin FY, Wang T, Kao JH, Chen DS. Вирусные факторы коррелируют с сероконверсонином е-антигена гепатита В у пациентов с хроническим гепатитом В. Liver Int. 2006; 26: 949–55.

Артикул
CAS
PubMed

Google Scholar

10.

Лю CJ, Chen BF, Chen PJ, Lai MY, Huang WL, Kao JH, Chen DS.Роль вирусной нагрузки гепатита В и промотерации базального ядра в гепатоцеллюлярной карциноме у носителей гепатита В. J Infect Dis. 2006; 193: 1258–65.

Артикул
CAS
PubMed

Google Scholar

11.

Pas SD, Fries E, De Man RA, Osterhaus AD, Niesters HG. Разработка количественного анализа ДНК вируса гепатита В в режиме реального времени и сравнение с двумя коммерческими анализами. J Clin Microbiol. 2000; 38: 2897–901.

CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar

12.

Ronsin C, Pillet A, Bali C, Denoyel GA. Оценка количественного теста COBAS AmpliPrep — выделение общей нуклеиновой кислоты — COBAS TaqMan вируса гепатита B (HBV) и сравнение с анализом VERSANTHBV DNA 3.0. J Clin Microbiol. 2006; 44: 1390–9.

Артикул
CAS
PubMed
PubMed Central

Google Scholar

13.

Sum SS, Wong DK, Yuen JC, Lai CL, Yuen MF. Сравнение теста COBAS TaqMan HBV с тестом COBAS Amplicormonitor для измерения инсерции ДНК вируса гепатита B.J Med Virol. 2005; 77: 486–90.

Артикул
CAS
PubMed

Google Scholar

14.

Йео В., Мо ФК, Чан С.Л., Люн Н.В., Хуэй П., Лам Вайоминг, Мок Т.С., Лам К.С., Хо В.М., Ко Дж., Тан Дж.В., Чан А.Т., Чан П.К. Вирусная нагрузка гепатита B позволяет прогнозировать выживаемость пациентов с ГЦК, проходящих системную химиотерапию. Гепатология. 2007; 45: 1382–9.

Артикул
CAS
PubMed

Google Scholar

15.

Yim HJ, Byun KS, Chang YJ, Suh YS, Yeon JE, Lee CH, KwonJA Yoo W, Kim SO, Hong SP. Уровни репликации вируса гепатита B (HBV) во время нерепликативной фазы: количественное определение HBV с помощью ПЦР в реальном времени в Корее. Dig Dis Sci. 2007; 52: 2403–9.

Артикул
CAS
PubMed

Google Scholar

(PDF) Сравнение количественной ПЦР ДНК вируса гепатита В в реальном времени (ОТ-ПЦР) с ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

Ссылки

1.Baig S (2009) Гендерное неравенство в инфицировании вирусом гепатита B. Врачи J Coll. Surg Pak 19: 598-600.

2. Чопра Г.С., Гупта П.К., Ананд А.С., Варма П.П., Наир В. и др. (2005) ПЦР-анализ ДНК HBV в реальном времени:

Значение и первый опыт в вооруженных силах. Медицинский журнал вооруженных сил Индии 61: 234-237.

3. Ян Г, Лю Дж, Хан С., Се Х, Ду Рет и др. (2007) Связь между инфекцией вируса гепатита B и генотипированием

HLA-DRB1 у пациентов Шэньси Хань на северо-западе Китая. Тканевые антигены 69: 170-175.

4. Каудли К.В., Ван СС, Уэлч С., Робертс Х., Бросгарт К.Л. (2012) Распространенность хронического гепатита B среди

рожденных за границей лиц, проживающих в США, по странам происхождения. Гепатология 56: 422-433.

5. Порыв I (1996) Эпидемиология инфекции гепатита В в Западной части Тихого океана и Юго-Восточной Азии. Кишечник. Холодный

Spring Harb Perspect Med 38: 18-23.

6. Kolassery S, (2017) Корреляция количественного определения HBsAg с помощью ELISA с сывороточной ДНК вируса гепатита B

количественная ПЦР у пациентов с хроническим гепатитом B.Международный. Журнал исследований в области медицинских наук 5:

2422-2425.

7. Лаванчи Д., Кейн М. (2016) Глобальная эпидемиология вирусной инфекции гепатита В. Вирус гепатита B в

болезней человека, Springer 187-203.

8. Нурали С., Хаким С.Т., Маклин Д., Казми С.У., Багасра О. (2008) Распространенность генотипа вируса гепатита В D

у женщин в Карачи, Пакистан. Журнал инфекции в развивающихся странах 2: 373-378.

9.Martinot ‐ Peignoux M, Asselah T Marcellin P (2015) Количественное определение HB sAg для оптимизации лечения

Мониторинг пациентов с хроническим гепатитом B. Liver International 35: 82-90.

10. Фостер Г.Р., Ирвинг В.Л., Чунг М.К., Уокер А.Дж., Хадсон Б.Э. и др. (2016) Влияние противовирусной терапии прямого действия

у пациентов с хроническим гепатитом С и декомпенсированным циррозом печени. Журнал гепатологии 64: 1224-

1231.

11. Дегучи М1, Ямасита Н., Кагита М., Асари С., Иватани Ю. и др.(2004) Количественное определение поверхностного антигена

гепатита В с помощью автоматического хемилюминесцентного иммуноанализа на микрочастицах. Журнал вирусологических методов 115:

217-222.

12. Kuhns MC, Kleinman SH, McNamara AL, Rawal B, Glynn S, et al. (2004) Отсутствие корреляции между

уровнями HBsAg и HBV ДНК у доноров крови с положительным результатом на HBsAg и anti-HBc: последствия для

будущей политики скрининга на HBV. Переливание 44: 1332-1339.

13. Озарас Р., Табак Ф., Тахан В., Мерт А., Акин Х. и др. (2008) Корреляция количественного анализа HBsAg и

уровней ДНК HBV во время хронического лечения HBV. Болезни пищеварения и науки 53: 2995-2998.

14. Вурстхорн К., Юнг М., Рива А., Гудман З. Д., Лопес П. и др. (2010) Кинетика снижения поверхностного антигена гепатита В

за 3 года лечения телбивудином у пациентов с положительным антигеном гепатита В. Гепатология 52:

1611-1620.

15. Такур В., Гуптан Р.К., Казим С.Н., Малхотра В., Зарин С.К. (2002) Профиль, спектр и значение генотипов HBV

у пациентов с хроническими заболеваниями печени на Индийском субконтиненте.Журнал гастроэнтерологии и

гепатологии 17: 165-170.

16. Хаким С., Казми С.У., Багасра О. (2008) Распространенность генотипов гепатита В и С среди молодых

практически здоровых женщин Карачи-Пакистан. Ливия. Журнал медицины 3: 66-70.

17. Оздил Б., Косар А.М., Аккиз Х., Сандикчи М.Ю., Кече С. (2009) Отрицательная корреляция между вирусной нагрузкой и уровнями

HBsAg у пациентов с хронической HBV-инфекцией. Архив вирусологии 154: 1451-1455.

18. Кохмото М., Эномото М., Тамори А., Хабу Д., Такеда Т. и др. (2005) Количественное определение поверхностного антигена гепатита B

с помощью хемилюминесцентного иммуноанализа во время лечения ламивудином хронических носителей вируса гепатита B

. Журнал медицинской вирусологии 75: 235-239.

19. Сонневельд М., Зутендейк Р., Янссен Х.Л. (2011) Мониторинг поверхностного антигена гепатита В и лечение

хронического гепатита В. Журнал вирусного гепатита 18: 449-457.

Быстрое и количественное определение вируса гепатита В

ВВЕДЕНИЕ

Вирус гепатита В (HBV) — это вирус с оболочкой с небольшим (3,2 т.п.н.) частично двухцепочечным геномом ДНК, который вызывает острые и хронические инфекции ^[ ¹ ^]. Воздействие инфекции HBV на общественное здоровье огромно: по оценкам, распространенность составляет 2 миллиарда инфицированных и 360 миллионов хронически инфицированных ^[ ² ^]. Диагноз HBV-инфекции во многом зависит от серологических и молекулярных тестов.В серологических тестах используются анализы крови на основе сыворотки, которые можно анализировать с помощью иммуноферментного анализа либо качественно, либо количественно ^[ ³ ^]. Тесты идентифицируют кодируемые вирусом антигены и соответствующие им антитела: поверхностный антиген гепатита B (HBsAg), анти-HBs, е-антиген гепатита B (HBeAg), анти-HBe и антитела к корному антигену гепатита (anti-HBc). Напротив, молекулярные тесты сосредоточены на количественной вирусной нагрузке, генотипировании, мутациях устойчивости к лекарственным препаратам и тестах на основные / предварительные мутации.

В клинической практике качественные тесты на HBsAg служат диагностическими маркерами для пациентов с инфекцией HBV. Совсем недавно количественные методы определения HBsAg стали использоваться для прогнозирования результатов лечения при определении на ранних этапах лечения или на исходном уровне ^[ ⁴ ^]. Однако выявление HBV-ДНК-положительных случаев, в которых не обнаруживается HBsAg, является весьма обнадеживающим фактором для применения молекулярного тестирования. В этой статье рассматриваются наиболее часто используемые методы количественного определения HBsAg и ДНК HBV (рис. 1).

Рисунок 1 Количественные методы обнаружения вируса гепатита B.

¹ Эти методы являются качественными или полуколичественными для определения HBsAg. HBsAg: поверхностный антиген гепатита B.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ДЛЯ HBsAg

С момента открытия HBsAg в 1965 году ^[ ⁵ ^], он служил биомаркером для диагностики инфекции HBV.Методы обнаружения HBsAg были впервые описаны в 1970-х годах с использованием электронной микроскопии, радиоиммуноанализа и иммуноферментных анализов ^[ ⁶ ^— ⁸ ^], которые были громоздкими, трудоемкими и ограничивались исследовательскими условиями. С тех пор были разработаны различные диагностические методы для количественного определения HBV.

В начале 1990-х количественное определение HBsAg считалось простым, многообещающим и недорогим методом мониторинга репликации вируса у пациентов с хроническим гепатитом В (ХГВ), получавших терапию интерфероном (ИФН) ^[ ⁹ ^] .Количественное определение HBsAg связано с концентрацией ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (кзкДНК), устойчивой внутрипеченочной формы ДНК HBV ^[ ¹⁰ ^, ¹¹ ^]. Предполагается, что количество циркулирующего HBsAg является предиктором ответа на противовирусную терапию. В настоящее время разработаны стандартные количественные анализы HBsAg, которые полностью автоматизированы и имеют высокую пропускную способность. Здесь кратко представлены два коммерчески доступных теста.

The Architect HBsAg QT (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA) — это автоматизированный метод иммуноанализа хемилюминесцентных микрочастиц, который является наиболее широко используемым в клинической практике ^[ ¹² ^]. Анализ Architect HBsAg QT — это двухэтапный иммуноанализ с гибкими протоколами анализа, называемый Chemiflex, для количественного измерения концентраций HBsAg в сыворотке и плазме ^[ ¹³ ^]. Система Architect HBsAg может обнаруживать даже 0.2 нг / мл HBsAg с динамическим диапазоном 0,05–250,0 МЕ / мл (1 МЕ / мл эквивалентно 1–10 нг / мл HBsAg) ^[ ¹⁴ ^]. Анализатор способен обрабатывать до 800 тестов в час.

Elecsys HBsAg II (Roche Diagnostics, Индианаполис, Индиана, США) — еще один популярный метод количественного определения HBsAg ^[ ¹⁵ ^]. Elecsys HBsAg II — это «сэндвич-анализ» с общим временем тестирования 18 мин. Результаты представлены в виде индекса отсечки (выборка / отсечка сигнала).Выборка считается неактивной, если индекс <0,9, тогда как выборки со значением индекса> 1,0 интерпретируются как реактивные ^[ ¹⁵ ^].

Эти два метода можно уверенно использовать для количественного определения HBsAg для наиболее распространенных генотипов HBV. Эти тесты просты в использовании, недороги и требуют быстрого выполнения; аналитические характеристики анализов в целом удовлетворительны.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ДЛЯ ДНК ВГВ

В связи с увеличением распространенности серологически отрицательных инфекций ВГВ (HBeAg-отрицательный ХГВ и скрытая инфекция ВГВ) и быстрым появлением диагностических мутантов, ускользающих от вируса, обнаружение ДНК ВГВ привлекло больше внимания в клинической медицине ^[ ¹⁶ ^].Обнаружение ДНК HBV в периферической крови является надежным маркером активности HBV, в то время как высокие уровни ДНК HBV связаны с более высокой частотой гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) и более быстрым прогрессированием цирроза ^[ ¹⁷ ^]. Кроме того, обнаружение ДНК HBV полезно в повседневной клинической практике для выявления людей, которым требуется противовирусное лечение, и предоставления им наиболее подходящей терапии ^[ ¹⁸ ^]. В настоящее время для количественной оценки ДНК HBV используются различные молекулярные технологии, такие как ультрафиолетовая (УФ) спектрофотометрия, полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени, цифровая ПЦР, методы изотермической амплификации и биосенсоры ^[ ¹⁹ ^— ²² ^].Здесь мы рассмотрим быстрые и количественные методы, которые использовались для обнаружения ДНК HBV.

УФ-спектрофотометрия

Ароматические кольца оснований поглощают УФ-свет с максимальным пиком при 260 нм. Когда луч УФ-света проходит через образец, содержащий ДНК или РНК, степень поглощения УФ-излучения образцом зависит от концентрации ДНК или РНК. Количество УФ-света, поглощенного серией стандартных количеств ДНК, измеряется для калибровки метода, и отношение УФ-света, поглощенного неизвестным образцом, измеряется и наносится на калибровочную кривую для определения концентрации ДНК или РНК.

Приборы NanoDrop (Thermo Scientific, Уилмингтон, Делавэр, США) основаны на УФ-спектрофотометрии и используют запатентованную систему удержания образцов, которая позволяет количественно определять ДНК или РНК из 1-2 мкл образцов ^[ ²³ ^]. Допустимые диапазоны концентраций составляют 0,4-15000 нг / мкл. Для инструментов NanoDrop ^[ ²³ ^] не требуется специальной подготовки проб.

ПЦР в реальном времени

С момента разработки в 1983 году Кэри Маллис ^[ ²⁴ ^], ПЦР стала важным инструментом для молекулярных биологов, а ее применение в системе обнаружения нуклеиновых кислот произвело революцию в количественном анализе ДНК. и РНК.Методы ПЦР быстро развивались за последние несколько лет, и их количественное применение способствовало развитию ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени следует общему принципу обычной ПЦР, и ее ключевой особенностью является то, что амплифицированная ДНК обнаруживается по мере развития реакции в реальном времени. Этот новый подход имеет более широкий динамический диапазон по сравнению с традиционной ПЦР. Наиболее часто используемыми реагентами для ПЦР в реальном времени являются зонды TaqMan ^[ ²⁵ ^]. Зонды TaqMan представляют собой зонды гидролиза, которые были разработаны в 1991 году для повышения специфичности количественной ПЦР ^[ ²⁶ ^].На рисунке 2 показан механизм реакции ПЦР в реальном времени на основе зондов TaqMan.

Рис. 2 Механизм реакции полимеразной цепной реакции в реальном времени на основе технологии зондов TaqMan.

Зонд TaqMan представляет собой олигонуклеотидный зонд, который имеет флуоресцентный репортер на 5 ’конце и гаситель, прикрепленный к 3’ концу. После гибридизации с целевой последовательностью во время отжига зонд TaqMan расщепляется ДНК-полимеразой, которая отделяет флуоресцентный репортер от гасителя. Как только они разделены, сигнал излучается и обнаруживается в машине реального времени. Интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству произведенного продукта ПЦР. FRET: Флуоресцентный резонансный перенос энергии.

В исследовании Abe et al. ^[ ²⁷ ^] сообщалось о чувствительном, точном и воспроизводимом анализе количественного определения ДНК HBV на основе ПЦР в реальном времени с использованием зондов TaqMan. Их результаты показали, что предел обнаружения составляет всего 10 копий на реакцию, с линейной стандартной кривой между 10 и 10 ⁸ копий ДНК на реакцию.Коэффициент вариации как для меж-, так и для внутриэкспериментальной изменчивости показал замечательную воспроизводимость.

Sitnik et al. ^[ ²⁸ ^] разработал анализ ПЦР в реальном времени для количественного определения ДНК HBV с TaqMan и зондами связывания малых бороздок (MGB). В этом анализе праймеры и зонды были сконструированы с использованием выравнивания последовательностей всех генотипов HBV для равной амплификации всех генотипов. Анализ имел динамический диапазон от 50 до 10 ⁸ МЕ / мл.

Хотя многие лаборатории разработали собственные анализы на основе ПЦР в реальном времени, во всех из них отсутствовал контроль качества и стандартизация ^[ ³ ^], что ограничивало их применение в клинической диагностике. Крупные диагностические компании также предоставляют коммерческие количественные анализы. Эти анализы различаются по пределу обнаружения и динамическому диапазону: первая версия страдала от узкого динамического диапазона от 10 ² до 10 ⁵ копий / мл, в то время как предел обнаружения нового анализа ниже 50 МЕ / мл с динамический диапазон приблизительно 10 ⁸ МЕ / мл ^[ ²⁹ ^— ³² ^].Недавно Всемирная организация здравоохранения установила универсальный стандарт количественного определения ДНК HBV, измеряемый в МЕ / мл, с целью сопоставления различных результатов с использованием единой контрольной единицы ^[ ³³ ^]. Однако значительная вариабельность количественной оценки между различными анализами может происходить случайным образом, несмотря на стандартизацию единиц отчетности и в целом хорошую корреляцию между различными анализами ^[ ³⁴ ^, ³⁵ ^].Следовательно, пациентов рекомендуется контролировать с помощью одного теста ^[ ¹ ^].

Цифровая ПЦР

Цифровая ПЦР, разработанная Фогельштейном и др. ^[ ³⁶ ^], является усовершенствованием традиционных методов ПЦР, которые можно использовать для количественной оценки и непосредственной клональной амплификации нуклеиновых кислот, включая ДНК, кДНК. , и РНК. Ключевое различие между цифровой и традиционной ПЦР заключается в методе измерения; цифровая ПЦР является более точным методом, чем обычная ПЦР ^[ ³⁷ ^].Образец разделяется с помощью цифровой ПЦР, так что отдельные молекулы нуклеиновой кислоты в образце локализуются и концентрируются во многих отдельных областях. Разделение образца позволяет оценить количество молекул, предполагая, что молекулярная популяция следует распределению Пуассона. Хиндсон и др. ^[ ³⁸ ^] разработали принципиально отличный метод разделения — цифровую ПЦР по каплям, которая разделяет образец на 20000 капель и обеспечивает цифровой подсчет нуклеиновых кислот.

Высокочувствительные методы позволяют различать различия в количестве копий HBV среди образцов, особенно в случаях низкого числа копий (, например, , нуклеиновые кислоты, извлеченные из тканей). Huang и др. ^[ ³⁹ ^] применили цифровую ПЦР по каплям для измерения количества копий HBV в зафиксированной формалином парафиновой (FFPE) ткани HCC. С помощью серологических тестов был классифицирован 131 образец HCC FFPE с различными стадиями опухоли и клиническими признаками.Число копий HBV было успешно определено с помощью цифровой ПЦР по каплям для всех тканей FFPE с числом копий от 1,1 до 175,5 копий / мкл. Эти результаты показали, что капельная цифровая ПЦР улучшает аналитическую чувствительность и специфичность измерения нуклеиновых кислот до уровня одной молекулы и подходит для количественного определения ДНК HBV.

Методы изотермической амплификации

Анализы на основе ПЦР являются наиболее широко используемыми методами количественного определения ДНК HBV; однако им нужна термоциклированная машина для разделения цепей ДНК и амплификации фрагментов ^[ ²¹ ^].Методы изотермического усиления осуществляются при постоянной температуре и не требуют термоциклера. Методы изотермической амплификации были разработаны в соответствии с новыми открытиями в молекулярной биологии синтеза ДНК / РНК и функцией амплификации нуклеиновых кислот in vitro и некоторых дополнительных белков. Здесь мы описываем несколько методов изотермической амплификации, которые использовались для количественного определения ДНК HBV.

Петлевая изотермическая амплификация

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) — это однотрубный метод амплификации ДНК ^[ ⁴⁰ ^].LAMP можно комбинировать с этапом обратной транскрипции, чтобы сделать возможным обнаружение РНК ^[ ⁴¹ ^]. В LAMP последовательность-мишень амплифицируется при постоянной температуре 60-65 ° C с использованием двух или трех наборов праймеров и полимеразы с высокой активностью смещения цепи и активностью репликации. Дополнительная пара петлевых праймеров может ускорить амплификацию ^[ ⁴² ^]. Из-за специфической природы праймеров количество продуктов ДНК в LAMP значительно выше, чем в амплификации на основе ПЦР ^[ ⁴² ^].По сравнению с ПЦР, LAMP был менее чувствителен к ингибиторам в сложных образцах, таких как кровь, из-за использования другой ДНК-полимеразы. Однако сложная конструкция праймеров считается слабым местом LAMP и может ограничивать ее применение в некоторых аспектах молекулярной биологии ^[ ²¹ ^, ⁴¹ ^].

Исходная статья о LAMP, которая была опубликована в 2000 году Notomi et al ^[ ⁴⁰ ^], показала, что 600 и 6000 копий ДНК HBV были обнаружены через 13 и 11 минут соответственно, что указывает на высокая специфичность и эффективность для выявления HBV.Cai et al. ^[ ⁴³ ^] разработали точный и быстрый протокол флуорогенной LAMP в реальном времени для количественного определения HBV. Их исследование продемонстрировало динамический диапазон восьми порядков величины, нижний предел обнаружения 210 копий / мл, низкую вариабельность между анализами и внутри анализов (4,24% -12,11%) и отличную корреляцию с ПЦР в реальном времени ( R ² = 0,96). О подобных анализах LAMP сообщалось другими, что указывает на то, что LAMP может быть полезен в будущем в качестве недорогой альтернативы для количественного определения ДНК HBV ^[ ⁴⁴ ^, ⁴⁵ ^].

Транскрипционная амплификация

Транскрипционная амплификация (ТМА) — это метод изотермической амплификации, используемый в исследованиях молекулярной биологии и в клинических лабораториях для быстрой диагностики инфекций. В отличие от ПЦР, этот метод включает транскрипцию РНК ( через РНК-полимеразу ) и синтез ДНК ( через обратную транскриптазу ). Есть еще несколько различий между ТМА и ПЦР: (1) ТМА изотермична; (2) ТМА производит РНК, а не ампликоны ДНК.Поскольку РНК более лабильна в лабораторных условиях, это снижает возможность переноса загрязнения; и (3) ТМА производит 100-1000 копий за цикл (ПЦР дает только две копии за цикл), что приводит к увеличению количества продуктов нуклеиновых кислот в 10 миллиардов раз в течение 15-30 минут ^[ ⁴⁶ ^].

Kamisango et al. ^[ ⁴⁷ ^] разработали чувствительный и количественный анализ с использованием ТМА и анализа защиты от гибридизации для обнаружения ДНК HBV в сыворотке. Анализ показал диапазон обнаружения от 5 × 10 ³ до 5 × 10 ⁸ эквивалентов генома / мл. Выполнение ручного анализа среднего размера занимает около 5 часов. Ide et al. ^[ ⁴⁸ ^] отметили, что ТМА была более полезной для понимания изменений уровня ДНК HBV, чем анализ амплификации сигнала разветвленной ДНК у пациентов с ХГВ, получавших ламивудин. Kubo et al. ^[ ⁴⁹ ^] исследовали полезность ТМА для оценки активной степени гепатита и оценки рецидива после резекции ГЦК, связанного с HBV.

Амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот

Амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) аналогична ТМА, которая была разработана Комптоном ^[ ⁵⁰ ^] в 1991 году для амплификации последовательностей РНК. Этот метод также можно использовать для амплификации ДНК с модификациями основного метода, такими как дизайн праймера, экстракция образца и денатурация матрицы ^[ ¹⁶ ^]. По сравнению с ПЦР, основными преимуществами NASBA являются: (1) он работает в изотермических условиях — обычно при постоянной температуре 41 ° C; и (2) он более быстрый и чувствительный, чем ПЦР в медицинской диагностике ^[ ⁵¹ ^].

Йейтс и др. ^[ ⁵² ^] разработали систему количественного определения ДНК HBV, основанную на амплификации с помощью NASBA и обнаружении в реальном времени с помощью технологии молекулярных маяков. Диапазон обнаружения анализа составляет 10 ³ -10 ⁹ копий / мл в плазме или сыворотке с хорошей воспроизводимостью и точностью. Deiman et al. ^[ ⁵³ ^] использовали NASBA, включая расщепление рестрикционным ферментом для амплификации ДНК HBV, и обнаружили, что чувствительность нормального NASBA улучшалась в 100-1000 раз, когда расщепление рестрикционным ферментом выполнялось до амплификации. .Предел обнаружения составил 10 МЕ / мл с динамическим диапазоном обнаружения 10 ² -10 ⁹ МЕ / мл.

Амплификация по роликовому кругу

Амплификация по роликовому циклу (RCA) — это простой, надежный и изотермический метод амплификации, который управляется ДНК-полимеразой для создания продукта с длинным тандемным повтором на основе кольцевой ДНК-матрицы ] . Этот метод не требует передового лабораторного оборудования или экспериментального опыта.По сравнению с ПЦР, основные преимущества RCA включают: (1) она устойчива к ингибиторам, присутствующим в клинических образцах, и почти не требует оптимизации анализа ^[ ¹⁶ ^]; и (2) он может усиливать мишени на твердой подложке или в растворе, что дает возможность для применения микроматрицы и биосенсора ^[ ⁵⁵ ^] (рис. 3).

Рис. 3 Схема реакции амплификации по катящемуся кругу.

RCA быстро синтезирует несколько копий одной круглой матрицы с использованием одного праймера. RCA: усиление катящегося круга.

Свойство кольцевой матрицы для RCA делает его идеальным для обнаружения ДНК HBV, особенно кзкДНК. Маргеридон и др. ^[ ⁵⁶ ^] сообщили, что кзкДНК из биопсии печени может быть амплифицирована всего с 13 копий с помощью RCA. Martel и др. ^[ ⁵⁷ ^] разработали метод с использованием in vitro завершения / лигирования плюс-цепи HBV релаксирующей кольцевой ДНК и амплификации с использованием RCA.Метод позволяет амплифицировать полные геномы HBV из сыворотки с вирусной нагрузкой от 10 ³ до 10 ⁸ МЕ / мл.

Упомянутые выше методы изотермической амплификации обладают рядом преимуществ по сравнению с ПЦР, самое главное, они не требуют дорогостоящего и дорогостоящего термоциклера. Сравнение методов изотермической амплификации и традиционной ПЦР показано в таблице 1.

Таблица 1 Характеристики изотермических методов амплификации и полимеразной цепной реакции, рассмотренных в этой статье.

Толерантность к биологическим компонентам

Метод	Требования к температуре ( ° C )	Кол-во ферментов	Дизайн праймера	Метод обнаружения продукта	Возможность быстрого обнаружения
ПЦР	55-95	1	Простой	GE, ELISA, в реальном времени	Да	Нет
IAM 908 60-65	1	Сложный	GE, мутность, в реальном времени	Да	Да
TMA	50-60	2	Простой	GE, ELISA, в реальном времени ECL	Да	Нет
NASBA	37-41	2 или 3	Простой	GE, ELISA, R eal-time, ECL	Да	Нет
RCA	37	1	Simple	GE, Real-time	Да	Нет

Биосенсоры

Биосенсоры — это аналитические устройства, используемые для обнаружения, которые объединяют биологический компонент с физико-химическим детектором ^[ ²² ^].В последнее время в клинических исследованиях используется все больше биосенсоров; Типичным примером является биосенсор глюкозы в крови, который использует глюкозооксидазу для разрушения глюкозы в крови ^[ ⁵⁸ ^, ⁵⁹ ^]. Большинство клинических исследований биосенсоров было основано на иммунологических реакциях или гибридизации ДНК, и биосенсоры всегда давали быстрые результаты с высокой чувствительностью ^[ ⁶⁰ ^— ⁶² ^].

Электрохимические биосенсоры: Электрохимические биосенсоры работают, обнаруживая изменения тока или потенциала, вызванные реакциями связывания, которые происходят на поверхности электрода или вблизи нее ^[ ⁶³ ^]. В последнее время электрохимические биосенсоры продемонстрировали чувствительность, селективность и недорогое обнаружение последовательностей ДНК и привлекли к себе значительное внимание. Ding et al. ^[ ⁶⁴ ^] описали безметочный электрохимический биосенсор для обнаружения олигонуклеотидов, связанных с последовательностями HBV через взаимодействия ДНК с окислительно-восстановительным комплексом 2,9-диметил-1. , 10-фенантролин кобальт [Co (dmp) (H ₂ O) (NO ₃) ₂].Эксперимент проводился путем гибридизации 21-мерных ДНК-зондов, модифицированных на стеклоуглеродном электроде, с ДНК-мишенью и кобальтом [Co (dmp) (H ₂ O) (NO ₃) ₂], размеры которых были сопоставимы с размерами небольшая бороздка нативной двойной спирали ДНК, которая использовалась в качестве электрохимического индикатора. В оптимальных условиях электрический сигнал имел линейную зависимость с концентрацией целевой ДНК от 3,96 × 10 ^-7 до 1,32 × 10 ^-6 моль / л, а предел обнаружения составлял 1.94 × 10 ^-8 моль / л.

Чжан и др. ^[ ⁶⁵ ^] разработали электрохимический биосенсор с использованием диаквабис [N- (2-пиридинилметил) бензамид-каппа-N-2, O] -кадмия (II) динитрата в качестве нового электроактивного индикатора. для обнаружения ДНК HBV человека. Гибридизацию между зондом и его комплементарной одноцепочечной ДНК определяли с помощью дифференциальной импульсной вольтамперометрии. Для оценки селективности разработанного электрохимического ДНК-биосенсора были проведены эксперименты с некомплементарными олигонуклеотидами.ДНК HBV может быть количественно определена в диапазоне от 1,01 × 10 ^-8 до 1,62 × 10 ^-6 моль / л с хорошей линейностью (γ = 0,9962). Предел обнаружения составил 7,19 × 10 ^-9 моль / л.

Кварцевые биосенсоры микровесов: Пьезоэлектрические материалы, обычно кристаллы, генерируют электрический потенциал в ответ на механическую силу ^[ ¹⁹ ^]. Пьезоэлектрические биосенсоры чувствительны к массе, и дополнительная масса сенсора вызывает заметное изменение резонансной частоты кристалла.Наиболее распространенным типом пьезоэлектрических биосенсоров являются кварцевые микровесы (QCM). Биосенсоры QCM привлекают все большее внимание в последние годы из-за их высокой чувствительности, хорошей специфичности, низкой стоимости, отсутствия меток и быстрого ответа ^[ ⁶⁶ ^].

Zhou et al. ^[ ⁶⁷ ^] разработали высокочувствительный пьезоэлектрический биосенсор ДНК HBV, основанный на чувствительной функции преобразования массы QCM и специфичности реакции гибридизации нуклеиновых кислот.Зонды нуклеиновой кислоты HBV были иммобилизованы на золотых электродах пьезоэлектрического кварцевого кристалла с АТ-разрезом 9 МГц с помощью метода полиэтилениминовой адгезии, сшивания глутаральдегидом или метода физической адсорбции. Сдвиги частоты гибридизации имеют хорошую линейную зависимость от количества ДНК HBV, когда количество составляло 0,02-0,14 мг / мл.

Пьезоэлектрический биосенсор на основе пептидной нуклеиновой кислоты (PNA) для мониторинга гибридизации геномной ДНК HBV в реальном времени был сконструирован Yao et al. ^[ ⁶⁸ ^].Зонды PNA могут объединять последовательности-мишени более эффективно и специфично, чем зонды ДНК. Зонды PNA были сконструированы и иммобилизованы на поверхности биосенсора, чтобы заменить обычные зонды ДНК для прямого обнаружения геномной ДНК HBV без предварительной амплификации с помощью ПЦР. Анализ гибридизации был завершен через 50 мин. Предел обнаружения составил 8,6 пг / л, а клиническая специфичность составила 94,44% по сравнению с ПЦР в реальном времени.

Микрокантилеверные биосенсоры: За последние два десятилетия микрокантилеверы превратились в чувствительный инструмент для обнаружения химических веществ и биоорганизмов.Из-за своего легкого веса, небольшого размера и высокого отношения поверхности к объему сенсоры микрокантилевер улучшают обнаружение и идентификацию биологических агентов на несколько порядков ^[ ⁶⁹ ^— ⁷¹ ^]. Метод обнаружения ДНК HBV с использованием динамического микрокантилеверного биосенсора, усиленного наночастицами диоксида кремния, был разработан Cha et al. целевая ДНК.В этом исследовании зонд захвата, иммобилизованный на поверхности микрокантилевера, и зонд обнаружения, конъюгированный с наночастицами кремнезема, были разработаны специально для целевой ДНК. ДНК HBV детектировали с использованием микрокантилеверного биосенсора, усиленного наночастицами диоксида кремния, с концентрацией от 23,1 фмоль / л до 2,3 нмоль / л, которая была получена с помощью процедуры ПЦР. Целевая ДНК HBV из 243-мер была обнаружена до пикомолярного уровня без увеличения наночастиц и до фемтомолярного уровня с использованием процесса усиления сигнала на основе наночастиц.

Биосенсоры поверхностного плазмонного резонанса: Биосенсоры поверхностного плазмонного резонанса (SPR) — это оптические сенсоры, которые используют специальные электромагнитные волны, поверхностные плазмонные поляритоны, чтобы исследовать взаимодействия между аналитами и элементами биомолекулярного распознавания, иммобилизованными на поверхности сенсора SPR ^[ ⁷³ ^] (Фиг.4). Биосенсоры SPR — это аналитическая технология в реальном времени без этикеток для обнаружения биологических аналитов и анализа биомолекулярных взаимодействий.

Рисунок 4 Схема биосенсора поверхностного плазмонного резонанса.

Падающий свет вызывает изменения длины волны или угла. Изменения были обнаружены в мониторе в реальном времени. SPR: поверхностный плазмонный резонанс.

Chuang et al. ^[ ⁴⁵ ^] сконструировал простой и недорогой картридж с датчиком SPR, основанный на методе LAMP для обнаружения HBV на месте.Матрица HBV, смешанная с 10 мкл раствора LAMP, может быть обнаружена новой системой за 17 минут, даже при ограниченной для обнаружения концентрации 2 фг / мл. Они также проанализировали коэффициенты корреляции между начальными концентрациями ДНК-матриц HBV и реакцией системы при различных временах амплификации, чтобы установить оптимальную конечную точку времени амплификации, равную 25 мин ( R ² = 0,98).

Все упомянутые выше быстрые и количественные методы обнаружения ВГВ приведены в таблице 2.

Таблица 2 Количественные методы обнаружения вируса гепатита В, обсуждаемые в этом обзоре.

Метод	Цель	Дальность обнаружения	Арт.
Architect	HBsAg	0,05–250,0 МЕ / мл	[12]
Elecsys	HBsAg	NA	HBsAg	NA	HBsAg	NA	ДНК HBV	0.4-15000 нг / мкл	[23]
Собственные анализы на основе ПЦР в реальном времени	ДНК HBV	10 ¹-10 ⁸ копий / реакция	[27]
Собственные анализы на основе ПЦР в реальном времени	ДНК HBV	50-10 ⁸ МЕ / мл	[19]
Цифровая ПЦР	ДНК HBV	Отдельная копия	[39]
IAM	ДНК HBV	48-10 ⁸ МЕ / мл	[43]
TMA	ДНК HBV	5 × 10 ³-5 × 10 ⁸ GE / мл	[47 ]
NASBA	ДНК HBV	10 ³-10 ⁹ копий / мл	[52]
	ДНК HBV	10 ²-106 I000U / мл	[53]
RCA	ДНК HBV	10 ³ -10 ⁸ МЕ / мл	[57]
Биосенсоры
Электрохимические биосенсоры	ДНК HBV	3. 96 × 10 ^-7 -1,32 × 10 ^-6 моль / л	[65]
	ДНК HBV	1,01 × 10 ^-8 -1,62 × 10 ^-6 моль / л	[66]
Биосенсоры QCM	ДНК HBV	0,02–0,14 мг / мл	[67]
	ДНК HBV	8,6 пг / л 44 06
Биосенсоры микрокантилевер	ДНК HBV	23.1 фмоль / л-2,31 нмоль / л	[69]
Биосенсоры SPR	ДНК HBV	2 фг / мл ¹	[45]

ПЕРСПЕКТИВЫ НА БУДУЩЕЕ

Уровень HBsAg был предложен в качестве маркера количества кзкДНК или инфицированной массы печени. Хотя сейчас доступны коммерческие анализы для количественного определения HBsAg, их динамический диапазон узок, и требуется ручное разведение, если концентрация HBsAg превышает динамический диапазон.Для быстрого и количественного определения HBV в клинической практике необходимы более чувствительные анализы с более широким диапазоном обнаружения.

В нашем обзоре описывается большинство анализов, которые использовались для количественного определения ДНК HBV, а также их достоинства и ограничения. ПЦР — наиболее широко используемый метод количественного определения ДНК HBV, но также известно, что он дает ошибочные результаты, вызванные механизмом гибридизации, и ложноотрицательные результаты из-за низкого числа копий HBV. Кроме того, ПЦР требует эффективного контроля тепловых циклов и, следовательно, требует больших затрат на инструменты.Развитие методов изотермической амплификации делает возможной амплификацию ДНК HBV без термоциклера, что также дает возможность миниатюризации биосенсора. Несмотря на изотермическую амплификацию и высокую чувствительность, методы изотермической амплификации по-прежнему менее широко используются для разработки коммерческих анализов обнаружения для количественного определения HBV. Биосенсоры обладают основными преимуществами, такими как скорость, чувствительность и низкая стоимость. Обнаружение и количественная оценка вирусных компонентов и вирусов с помощью биосенсоров — это новая концепция, которая все еще находится в зачаточном состоянии ^[ ⁶³ ^].Разработанные ранее тесты теперь интегрируются в другие новые платформы, такие как комбинация LAMP и биосенсоров ^[ ⁴⁵ ^].

Развитие быстрого количественного определения HBV продвигается в сторону упрощения процедур, устойчивости к грубым образцам, высокой чувствительности, специфической амплификации и надежных надежных характеристик. С развитием технологий количественная оценка HBV может быть перенесена из централизованных лабораторных помещений в другие места, такие как отделения неотложной помощи, кабинет врача и даже семью.В будущем тестирование на месте оказания медицинской помощи и на месте пациента может стать основным направлением ^[ ¹⁹ ^, ²⁰ ^].

Набор для количественной ПЦР AccuPower® HBV

Инфекцию вируса гепатита B можно определить путем обнаружения HBsAg (поверхностный антиген HBV). Но для того, чтобы различать хроническую и активную инфекцию, необходимо количественно определить уровни циркулирующей ДНК HBV и уровни ферментов печени. Количественная оценка с помощью ПЦР в реальном времени, которая имеет превосходную чувствительность и специфичность, позволяет врачам проверять эффективность лечения и предлагать более эффективное лечение.

Характеристики и преимущества

Обнаружение генотипа HBV: Генотипы HBV A, B, C, D, E, F и H обнаруживаются с высокой чувствительностью.
Подпись Удобство: Все компоненты для анализа находятся внутри пробирки.
Повышенная чувствительность и специфичность: Собственная технология HotStart компании Bioneer обеспечивает высокую чувствительность и специфичность.
Замечательная стабильность: Высушенный в вакууме премикс обеспечивает стабильные и воспроизводимые результаты.
Высокое качество: Все диагностические комплекты, производимые Bioneer, проходят строгий контроль качества.

Технические характеристики

Тип образца	Сыворотка, ЭДТА-плазма
Состав комплекта	Премикс для ПЦР, SPC 1 ~ 5, IPC, NTC, буфер SL, DEPC D.W.
Приборы	ExiStation ™ Универсальная система молекулярной диагностики или Exicycler ™ 96
Тесты	96

Представления

AccuPower ^® HBV Quantitative PCR Kit включает серийно разведенный стандартный положительный контроль (SPC) 1 ~ 5 для количественного определения HBV.

AccuPower ^® HBV Quantitative PCR Kit — результаты тестов с использованием клинических образцов. В наборе используется IPC во всех лунках для подтверждения правильности амплификации ПЦР.

Ориентированное на пользователя программное обеспечение ExiStation Manager или ExiDiagnosis автоматически анализирует результаты теста на основе значения Ct (порогового цикла).

Информация для заказа

Кат.№	Описание продукта
HBV-1111	AccuPower ® Набор для количественной ПЦР HBV (96 тестов)

Сопутствующие товары

Кат. №	Диагностический комплект MDx
Кат. №	Инструмент
Кат.№	Набор для экстракции нуклеиновых кислот

Обеспечение качества

Bioneer является обладателем сертификатов системы менеджмента качества по следующим стандартам.

ISO 13485 — сертификат

Свяжитесь с нами

Эл. Почта: [email protected]

Корреляция количественного определения HBsAg с помощью ELISA с количественной ПЦР ДНК вируса гепатита B в сыворотке крови у пациентов с хроническим гепатитом B | Колассеры

Kowdley KV, Wang CC, Welch S, Roberts H, Brosgart CL.Распространенность хронического гепатита B среди лиц иностранного происхождения, проживающих в Соединенных Штатах, в разбивке по стране происхождения. Гепатол. 2012; 56: 422-33.

Bosch FX, Ribes J, Cléries R, Díaz M. Эпидемиология гепатоцеллюлярной карциномы. Clin Liver Dis. 2005; 9: 191-211.

ID порывов ветра. Эпидемиология инфекции гепатита В в Западной части Тихого океана и Юго-Восточной Азии. Кишечник. 1996; 38 (Приложение 2): S18-23.

Всемирная организация здравоохранения. Гепатит B. Информационный бюллетень Всемирной организации здравоохранения No 204, 2014 г.Доступно по адресу http://www.who.int/mediacentre / fact sheet / fs204 / en /.

Лаванчи Д. Эпидемиология вируса гепатита B, бремя болезней, лечение, а также текущие и новые меры профилактики и контроля. J Viral Hepat. 2004; 11: 97-107.

Lok AS. Хронический гепатит B. N Engl J Med. 2002; 346: 1682-3.

Goldstein ST, Zhou F, Hadler SC, Bell BP, Mast EE, Margolis HS. Математическая модель для оценки глобального бремени гепатита B и воздействия вакцинации. Int J Epidemiol.2005; 34: 1329-39.

Гиш Р.Г., Локарнини С.А. Хронический гепатит B: современные стратегии тестирования. Clin Gastroenterol Hepatol. 2006; 4: 666-76.

Андерссон К.Л., Чанг РТ. Мониторинг во время и после противовирусной терапии гепатита В. Hepatol. 2009; 49: С166-73.

Дегучи М., Ямасита Н., Кагита М., Асари С., Иватани Ю., Цучида Т. и др. Количественное определение поверхностного антигена гепатита В с помощью автоматического иммунохемилюминесцентного иммуноанализа на микрочастицах. J Virol Methods. 2004; 115: 217-22.

Moucari R, Mackiewicz V, Lada O, Ripault MP, Castelnau C, Martinot-Peignoux M.Раннее падение уровня HBsAg в сыворотке: сильный предиктор устойчивого вирусологического ответа на пегилированный интерферон альфа-2a у HBeAg-отрицательных пациентов. Гепатол. 2009; 49: 1151-7.

Вурстхорн К., Юнг М., Рива А., Гудман З. Д., Лопес П., Бао В. и др. Кинетика снижения поверхностного антигена гепатита В за 3 года лечения телбивудином у антиген-положительных пациентов. Гепатол. 2010; 52: 1611-20.

Чан Х.Л., Вонг В.В., Це АМ, Цзе Ц, Чим АМ, Чан Х и др. Количественное определение поверхностного антигена гепатита В в сыворотке может отражать наличие вируса гепатита В в печени и прогнозировать ответ на лечение.Clin Gastroenterol Hepatol. 2007; 5: 1462-8.

Kuhns MC, Kleinman SH, McNamara AL, Rawal B, Glynn S, Busch MP. Отсутствие корреляции между уровнями HBsAg и ДНК HBV у доноров крови с положительным результатом на HBsAg и anti-HBc: последствия для будущей политики скрининга на HBV. Трансфус. 2004; 44: 1332-9.

Кохмото М., Эномото М., Тамори А., Хабу Д., Такеда Т., Кавада Н. и др. Количественное определение поверхностного антигена гепатита B с помощью иммунохемилюминесцентного иммуноанализа на микрочастицах во время лечения ламивудином.J Med Virol. 2005; 75: 235-9.

Озарас Р., Табак Ф., Тахан В., Озтюрк Р., Акин Х., Мерт А. и др. Корреляция количественного анализа уровней HBsAg и ДНК HBV при хроническом лечении HBV. Dig Dis Sci. 2008; 53: 2995-8.

Thakur V, Guptan RC, Kazim SN, Malhotra V, Sarin SK. Профиль, спектр и значение генотипов HBV у пациентов с хроническими заболеваниями печени на Индийском субконтиненте. J Gastroenterol Hepatol. 2002; 17: 165-70.

Андерссон К.Л., Чанг РТ. Мониторинг во время и после противовирусной терапии гепатита В.Гепатол. 2009; 49: С166-73.

Ozdil B, Cosar AM, Akkiz H, Sandikci MU, Kece C. Отрицательная корреляция между вирусной нагрузкой и уровнями HBsAg у пациентов с хронической HBV-инфекцией. Arch Virol. 2009; 154: 1451-5.

Озарас Р., Табак Ф., Тахан В., Озтюрк Р., Акин Х., Мерт А. и др.Корреляция количественного анализа уровней HBsAg и ДНК HBV при хроническом лечении HBV. Dig Dis Sci. 2008; 53: 2995-8.

Sonneveld MJ, Zoutendijk R, Janssen HL. Мониторинг поверхностного антигена гепатита B и ведение хронического гепатита B. J Viral Hepat. 2011; 18: 449-57.

AltoStar® HBV PCR Kit — Altona-Diagnostics EN

Наборы для ПЦР AltoStar ^® 1.5 разработаны для одновременного тестирования патогенов в согласованных циклических условиях и позволяют идентифицировать клинический патоген с использованием рабочего процесса молекулярной диагностики AltoStar ^{^®}. Набор AltoStar ^® HBV PCR Kit 1.5 разработан для надежного мониторинга вирусной нагрузки у пациентов, инфицированных HBV.

AltoStar ^® HBV PCR Kit 1.5 — это диагностический тест in vitro , основанный на технологии ПЦР в реальном времени, для обнаружения и количественной оценки специфической ДНК вируса гепатита B (HBV) (генотипы от A до H) у человека. Плазма с ЭДТА.
AltoStar ^® HBV PCR Kit 1.5 состоит из двух основных реагентов (мастер A и мастер B), четырех стандартов количественного определения (QS1 — QS4) и контроля без шаблона (NTC).

Продукт не лицензирован Министерством здравоохранения Канады и не одобрен или не одобрен FDA.Комплект доступен не во всех странах.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Обнаружение и количественная оценка специфической ДНК вируса гепатита В (HBV)
Обнаружение генотипов от A до H в плазме с ЭДТА человека
Готовый к использованию набор, включающий стандарты количественной оценки
Стандарты количественной оценки, откалиброванные по 4-му международному стандарту ВОЗ для HBV ДНК для методов амплификации нуклеиновых кислот (код NIBSC: 10/266)
Аналитическая чувствительность, указанная в МЕ / мл
Возможны смешанные партии: все типы образцов параллельно
Одновременная обработка: до 8 анализов в одном цикле
CE -IVD с маркировкой in vitro Диагностический тест

Набор для ПЦР AltoStar ^® HBV 1.5 представляет собой диагностический тест in vitro , основанный на технологии ПЦР в реальном времени, для обнаружения и количественной оценки специфической ДНК вируса гепатита B (HBV) человека (генотипы от A до H) в плазме с ЭДТА человека.

AltoStar ^® HBV PCR Kit 1.5 сконфигурирован для использования с системой CFX96 ™ Deep Well Dx (Bio-Rad) в сочетании с AltoStar ^® Automation System AM16, AltoStar ^® Purification Kit 1.5 и AltoStar ^® Внутренний контроль 1.5.

AltoStar

^® Набор для ПЦР HBV 1.5

Номер для заказа	AS0201513
Rxns	96
Типы образцов	Плазма EDTA
	Сухой лед человека
	Для использования с	AltoStar ^® Система автоматизации AM16 / AltoStar ^® Connect Software AltoStar ^® Purification Kit 1. Posted in Разное Навигация по записям Дует живот при беременности: Страница не найдена — MSN Крем инструкция: ДЕРМОВЕЙТ мазь — инструкция по применению, дозировки, аналоги, противопоказания Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт Найти: Рубрики Виды Мужской Разное Советы © 2025 КОПИИ БРЕНДОВЫХ ЧАСОВ

Вирусный гепатит В (HBV), количественный

Вирусный гепатит В (HBV), количественный

Вирус гепатита В (Hepatitis B Virus), количественное определение ДНК, ПЦР (ДНК HBV, колич.)

Сдать ДНК HBV, копий/мл (PCR real time) анализ во Владимире

Анализ на гепатит В

Вирус гепатита С, определение РНК (количественное)

Количественный тест

Качественный тест

Беременность и гепатит С

HCV, РНК количественно [реал-тайм ПЦР]

Услуги по взятию (сбору) биоматериала

Срок выполнения

Синонимы русские

Синонимы английские

Метод исследования

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Общая информация об исследовании

Что может влиять на результат?

Важные замечания

Также рекомендуется

Кто назначает исследование?

Тип биоматериала и способы взятия

Литература

Количественное определение ДНК ВГB | Биомедика

Для количественного определения ДНК вируса гепатита В в реальном времени могут потребоваться две разные мишени | Virology Journal

LOD дуплексного анализа ПЦР в реальном времени

Специфичность

Линейность

Сравнение вирусных нагрузок, определенных с помощью дуплексного анализа ПЦР в реальном времени с анализом CTM, v2

Сравнение вирусной нагрузки дуплексного анализа ПЦР в реальном времени с анализами ПЦР в реальном времени Daan

Сравнение вирусной нагрузки, определенной с использованием областей S и C, с дуплексным анализом ПЦР в реальном времени

Выравнивание последовательностей и вариабельность образцов, для которых количественные результаты S-области были более чем на 1.0 log

Проверка с использованием плазмид

(PDF) Сравнение количественной ПЦР ДНК вируса гепатита В в реальном времени (ОТ-ПЦР) с ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

Быстрое и количественное определение вируса гепатита В

Набор для количественной ПЦР AccuPower® HBV

Свяжитесь с нами

AltoStar® HBV PCR Kit — Altona-Diagnostics EN

AltoStar

Добавить комментарий Отменить ответ