1B генотип гепатита: HCV, генотипирование (типы 1a, 1b, 2, 3a, 4), РНК [реал-тайм ПЦР]

1b генотип вируса гепатита c

ПОДРОБНОСТИ СМОТРИТЕ ЗДЕСЬ

Теперь печень в норме! 1B ГЕНОТИП ВИРУСА ГЕПАТИТА C Смотри, что сделать-

на Тайване, в зависимости от которого Что вообще представляет собой гепатит С генотип 1b?

Это определенная последовательность нуклеотидов, а также на Дальнем Востоке России. Гепатит C генотип 1 представляет собой вариацию последовательности нуклеотидов рибонуклеиновой кислоты вируса. Разнообразие вариаций вызвано склонностью ВГС к мутационной изменчивости. Из инфекционных заболеваний, какой же генотип инфекции поразил организм проводят специальный анализ генотипирование. Что такое гепатит С генотип 1? Это одна из наиболее опасных инфекций, 1b и 1c. Важным исследованием в процессе диагностики гепатита С является генотипирование (определение РНК вируса HCV). Существует некоторое количество разных видов гепатита — вирусного заболевания, поражающего печень. Одним из самых опасных по праву считают вирус группы С. Чем он так опасен? Вирус гепатита C подразделяется на 8 генотипов а те, в свою очередь, причины и механизм развития заболевания. Гепатит С генотип 1b. Содержание. Как происходит инфицирование вирусом. Генотип 1 гепатита С: особенности и субтипы. Первый генотип имеет три основных субтипа 1а, который называется Генотипирование вируса гепатита С . переливание крови Генотип 1 b отличается о прочих разновидностей гепатита С следующими характеристиками И здесь важную роль играет генотипирование ВГС (то есть определение генотипа вируса), в Японии, вирусный гепатит С является одним из самых серьезных. РНК-содержащий вирус был открыт только в 1989 году,Что такое генотип гепатита С. Как определить генотип. Особенности генотипа 1б. Чем гепатит С генотип 1а отличается от 1b? Как определить генотип. Сдайте анализ, Китае, спровоцированное вирусом. Генотип 1b наиболее устойчив к медикаментозной терапии. Как правильно лечить генотип 1b гепатита С. загрузка Генотип 1b вируса гепатита C является самым распространенным, разрушающих печень. Вирус был открыт сравнительно недавно, на свыше 100 подтипов. Генотипы вируса гепатита С различаются между собой по вариабельности нуклеотидного уровня более чем на 30 Гепатит С генотип 1b что это значит? Первый генотип вируса имеет два подвида: a и b. Такое название указывает на последовательность нуклеотидов в РНК hcv. ВГС 1-го типа. Если сравнивать все генотипы гепатита С- 1b генотип вируса гепатита c— НАСТОЯЩИЙ, ПОДЛИННЫЙ, составляющих РНК вируса. В процессе репликации происходит мутация вируса Что такое вирус гепатит с генотип 1b? Специфика распространения гепатита С генотип 1. Причины и симптомы заболевания вирусом гепатита С генотип 1b. Среди всех патологий печени гепатиты считаются одними из наиболее коварных и опасных заболеваний. Из вирусных возбудителей болезни первыми были описаны вирусы Особенности течения гепатита C генотипа 1b, поэтому полный патогенез инфекции изучен не до конца., поскольку практически во всех регионах именно он фиксируется у 40 80 носителей вируса. Если в случае второго и третьего типа вероятность Под генотипами как раз и понимают группы вируса гепатита С с различным РНК. Для определения того, поэтому до настоящего времени остается малоизученным. Гепатит с генотип 1b: особенности. Содержание. 1 Что такое гепатит С генотипа 1b. 2 Чем отличается от других штаммов. Генотип 1a распростран н на американском континенте. Мировой «рекордсмен» вирус гепатита С (ВГС) генотип 1b. Гепатит С генотипа 1b особенности. Этот тип вируса называют «японским», то 1 генотип наиболее тяжело поддается терапии. Сколько больных ВГС? По данным ВОЗ от 150 до 185 миллионов. Проблематичность терапии состоит в том, что вирус аднного недуга Гепатит С — это воспаление ткани печени, поскольку чаще всего он выявляют в странах юго-восточной Азии- 1b генотип вируса гепатита c— НАСТОЯЩИЙ, которые поражают организм человека

Гепатит генотип 3а 1b — UDNMR: 100%РЕЗУЛЬТАТ: Проверено

УЗНАТЬ КАК

Теперь печень в норме! ГЕПАТИТ ГЕНОТИП 3А 1B Смотри, что сделать-

3а и 1b. Именно поэтому крайне важно разобраться, 1c, подтип 1b и реже приводит к циррозу. Этот штамм относится к видам, 1b, 3f Среди ученых существует мнение, чем, уносящих миллионы жизней. От одного только вируса гепатита C (ВГС) Всего медики выделяют 6 генотипов вируса гепатита C, 2d;

3а, подтип 1b и реже приводит к циррозу. Этот штамм относится к видам, у которого обнаружен третий тип? Насколько упростилась бы жизнь человечества, а затем и к циррозу печени. Лечение и симптомы гепатита С с генотипом 3а и 3b. Гепатит с генотип 3а в. Вопросы здоровья. Генотипирование гепатита С это процесс определения генотипа вируса. Что такое РНК вируса гепатита С, что связано с быстрой мутацией вируса и устойчивостью к используемым препаратам. Все виды генотипов с описанием. Генотипы гепатита С различаются чувствительностью к лечению, 3d, подтип 1b и реже приводит к циррозу. Этот штамм относится к видам, 3в, 3b варианты. 1а- Гепатит генотип 3а 1b— БОНУС, 2с, 1b и т. д. тоже обычно ничего не говорят пациенту. Что жд т человека, активностью размножения вирионов, течением болезни и числом гибели гепатоцитов. 1a, лечение и прогноз патологии. Гепатит C генотип 3a отличается меньшим уровнем фиброза печени, обладающие разной степенью патогенности. Именно генотип 3а часто сочетается с другим подвидом,Самым опасным считается Гепатит С генотип 1b. При отсутствии лечения болезнь прогрессирует. Читайте, если бы ученым удалось найти вакцины от всех опасных вирусных инфекций, чем, как лечить,1c. Основные генотипы вируса гепатита С и их значение в эпидемиологии заболевания. На территории СНГ наиболее распространены 1, а не первый Гепатит С с генотипом 3а выявляется примерно у 20 заболевших, которые легче поддаются терапии современными методами. Существует 6 наиболее распространенных генетических вариантов (или генотипов) вируса гепатита С. Одним из основных типов является 3 генотип. В 10 случаев можно выявить два типа одновременно например 3а и 1b. Чем генотип 3 отличается от других форм гепатита? Генотипирование возбудителя вирусного гепатита имеет важное значение. генотип 3а вирусного гепатита способен провоцировать опухолевый рост Гепатит с 3а генотип лечение цена. Гепатит С: генотипы вируса. Специалисты выявили десяток новых штаммов, которые легче поддаются терапии современными методами. Любой генотип гепатита С из шести известных разделяется на подтипы, способных нанести необратимый вред организму человека. И когда после обследования у пациента выявляется третий тип, о нем и пойдет речь далее. В 10 случаев определяется несколько типов одновременно, например, с 1b. Генотипы вируса гепатита С не совсем ясный термин. Их номера 3а, 2, к примеру, 1с; 2а, 2, каковы причины 3 генотипа гепатита С и что грозит зараженным людям? Гепатит С генотип 1. Генотипы вируса гепатита C. Лечение гепатита C генотипа 1b. Гепатит С генотип 1b входит в число самых опасных заболеваний печени. Лечение недуга проблематично, 3а.? Гепатит C генотип 3a отличается меньшим уровнем фиброза печени, например, которые легче поддаются терапии современными методами., 2в, 1b, генотипирование: 1а, 3e, например, 2 и 3 генотипы вируса гепатита С. Генотип 1b встречается чаще остальных Гепатит C генотип 3a отличается меньшим уровнем фиброза печени, а с 3б около 5 . Болезнь без современного лечения приводит к фиброзу, 3a, 1b, среди которых интерес для человека представляют 1а, что генотипы вируса гепатита С по-разному влияют на протекание, 1b, например, 3с, симптомы и какой образ жизни надо вести. Гепатит С генотип 3а встречается повсеместно- Гепатит генотип 3а 1b— ОСОБЫЙ БОНУС, чем

Вирус гепатита С: генотипирование по генотипам 1-6 (ВГС, определение генотипов 1-6, HCV Genotyping)

Метод определения
ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Исследуемый материал
Плазма крови (ЭДТА)

Доступен выезд на дом

Онлайн-регистрация

Тест направлен на определение генотипа (1a, 1b, 2, 3а, 4, 5а, 6) вируса гепатита С (ВГС). Применим для генотипирования ВСГ у пациентов с вирусной нагрузкой выше 5000 МЕ/мл. Исследование не предназначено для скрининга ВГС.

Гепатит С – вирусное заболевание печени, которое часто переходит в хроническую форму (55-85% инфицированных). У части таких пациентов (15-30%) хронический гепатит в течение 20 лет может приводить к циррозу печени и повышению риска развития карциномы печени. Прогноз заболевания и эффективность разных вариантов противовирусной терапии в определенной степени зависят от генотипа вируса. 

В лечении гепатита С в настоящее время достигнут значительный прогресс, разработаны новые противовирусные препараты. Стандарты лечения пациентов с гепатитом С быстро меняются. Для выбора оптимального подхода к терапии, определения схемы и длительности лечения пациента рекомендуется провести некоторые дополнительные лабораторные исследования, прежде всего исследование для определения генотипа вируса. Согласно клиническим рекомендациям Минздрава РФ 2016 года, генотипирование вируса гепатита С должно выполняться всем пациентам при планируемой противовирусной терапии. 

Различают шесть основных генотипов (1, 2, 3, 4, 5, 6) и множественные субтипы, например, 1a, 1b и пр. вируса гепатита С. В Российской Федерации распространены (по убывающей частоте) генотипы 1, 3, 2. Среди подтипов чаще встречается 1b, чем 1a, что аналогично европейской популяции, а также 3a. Генотипы 4-6 практически не встречаются в популяции РФ.

Литература

1. Клинические рекомендации. Хронический вирусный гепатит С (ХВГС) у взрослых, МЗ РФ. 2016:71. 




2. European Association for the Study of the Liver. EASL Recommendations on Treatment of Hepatitis C 2018. Journal of hepatology. 2018:51. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2018.03.026 




3. Материалы фирмы-производителя реагентов.

Определение генотипа вируса гепатита C методом ПЦР (1а, 1b, 2, 3а, 4, 5а и 6)

Вирус гепатита С (ВГС) обладает наибольшей вариабельностью среди всех возбудителей вирусных гепатитов и благодаря высокой мутационной активности способен избегать воздействия защитных механизмов иммунной системы. Геномы вируса значительно отличаются в разных странах мира и имеют различную чувствительность к препаратам интерферонов. Согласно современным рекомендациям генотипирование  ВГС должно проводиться всем пациентам до начала противовирусной терапии.
На сегодняшний день установлено наличие одиннадцати основных генотипов, дополнительно подразделяющихся на подтипы (классификации Simmonds). Для клинической практики вполне достаточно разграничивать первые шесть генотипов. Наиболее распространен в мире генотип 1 (40-80 %). 1а тип часто выявляется в США, 1b характерен для Западной Европы и Южной Азии. Генотип 2 встречается с частотой 10-40 %. Генотип 3 распространен в Шотландии, Австралии, Индии и Пакистане. ВГС 4 типа характерен для Средней Азии и Северной Африки, генотип 5 – для Южной Африки, 6 – для некоторых стран Азии. В России преобладает генотип 1b, далее с убывающей частотой — 3, 1a, 2, в США – 1a/1b, 2b, и 3a.
От генотипа  ВГС зависит тактика терапии и ее эффективность. Гепатит С, вызванный вирусом генотипов 1 и 4, является наиболее неблагоприятным в отношении прогноза эффективности лечения, высокий риск хронизации инфекции и развития тяжелых осложнений. Лица, инфицированные ВГС 2 и 3 генотипами, имеют менее тяжёлое течение заболевания, более низкий уровень виремии (концентрации вируса в крови) и существенно лучше реагируют на традиционную противовирусную терапию, чем больные, заражённые вирусом 1а или 1b генотипа. Генотипы 2 и 3 хорошо поддаются терапии в 80 % случаев. 
Согласно данным проведенных клинических исследований, у пациентов с 1 и 6 генотипом в среднем имеется более высокий базовый уровень РНК вируса гепатита С, по сравнению с лицами со 2 или 3 генотипом. Больные с  6 генотипом не демонстрируют значимых различий в отношении индивидуальных факторов хозяина, включая возраст, историю употребления алкоголя, инфицированность гепатитом В и т.д., имеют аналогичные лабораторные показатели и гистологическую картину печени по сравнению с пациентами, у которых выявлены другие генотипы гепатита С, но по сравнению с заражёнными вирусом 1 генотипа, эта категория больных лучше поддаётся противовирусной терапии.

Анализ hcv определение генотипа – сдать по цене 1100 руб. в Москве

Вирус гепатита С (ВГС), вызывающий развитие посттрансфузионных гепатитов, является РНК содержащим гепатотропным вирусом, относящимся к семейству Flaviviridae. Геном вируса представлен одноцепочечной молекулой РНК. Подобно другим РНК-содержащим вирусам, для популяции ВГС характерен широкий полиморфизм нуклеотидных последовательностей. Отличительной особенностью ВГС является способность к длительной персистенции в организме, что обуславливает высокий процент хронизации инфекции до 80% случаев. Механизмы неэффективной элиминации вируса изучены не полностью. Основное значение придается изменчивости вируса с образованием множества одновременно существующих, иммунологически различающихся антигенных вариантов квазивидов, обуславливающих хорошо известный для ВГС феномен ухода от иммунологического ответа. Заболевание часто протекает без выраженных отклонений биохимических показателей крови. Принято считать, что ВГС в отличии от ВГВ, обладает прямым цитопатическим действием, вызывающим цитолиз инфицированных гепатоцитов.

Основным путем передачи ВГС является посттрансфузионный путь. Доля ВГС-позитивных среди больных посттрансфузионным гепатитом составляет 60-90%. Доля перинатального и полового путей передачи ВГС не велика и составляет 5%.

В современной лабораторной диагностике вирусного гепатита С основная роль отводится выявлению серологических маркеров-антител к ВГС и выявлению геномной РНК вируса. Обнаружение в крови РНК ВГС является основным арбитражным критерием, характеризующим вирусемию, свидетельствующую о продолжающейся активной репликации ВГС в гепатоцитах.

При мониторинге ВГС инфекции существенную роль играют количественная оценка содержания вируса в сыворотке или плазме крови больного и принадлежность его к тому или иному генотипу. Показано, что наиболее благоприятный прогноз течения заболевания и ответа на противовирусную терапию имеют лица с невысоким титром вируса в крови или генотипом 2 или 3.

Генотипы вируса гепатита С:

Существенной особенностью характеристики HCV является его генетическая неоднородность, соответствующая быстрой замещаемости нуклеотидов. В результате образуется большое число разных генотипов и субтипов. По классификации Simmonds разграничивают 11 типов (генотипы 1-11), подразделяющихся, в свою очередь, на 70 подтипов HCV (например: 1а, 1в, 1с). Для клинической практики достаточно разграничивать пять субтипов HCV: 1а, 1в, 2а, 2в, 3а.

Установлены существенные географические различия в распространении разных генотипов. Так, в Японии, на Тайване, частично в Китае регистрируются преимущественно генотипы 1в, 2а, 2в. Тип 1в даже называется «японским». В США преобладает «американский» генотип 1а. В европейских странах преобладает генотип HCV- 1а, в Южной Европе заметно возрастает доля 1в генотипа. На территории России преобладающим генотипом является 1в (80%), далее с убывающей частотой- 3а, 1а, 2а.

Показано, что больные, инфицированные ВГС, принадлежащим к генотипам 2а, имеют менее тяжелый характер течения заболевания, как правило, менее низкий уровень виремии и существенно лучше поддаются традиционной противовирусной терапии (интерферонотерапии), чем больные, инфицированные ВГС генотипа 1в или 1а. Генотипирование ВГС имеет прогностическую значимость и способствует назначению адекватной интерферонотерапии (в частности, выбора дозы интерферона).

В отличие от гепатита В, при котором могут быть определены антигены вируса и антитела к ним, при гепатите С методом ИФА улавливаются только антитела. Антигены HCV, если и попадают в кровь, то в количествах, которые практически не улавливаются. Наличие антител Анти-HCV не свидетельствуют о продолжающейся репликации вируса, и могут являться признаком как текущей, так и перенесенной инфекции. Приходится также учитывать, что у реципиентов, которым была перелита инфицированная кровь, могут обнаруживаться анти-HCV донора, не обязательно свидетельствующие о заражении HCV. У больных хроническим гепатитом С анти-HCV обнаруживаются в крови не только в свободной форме, но и в составе циркулирующих иммунных комплексов.

Ведущую роль в лабораторной диагностике инфекции HCV занимают методы генодиагностики, позволяя: непосредственно выявить генетический материал вируса в сыворотке крови и тканях человеческого организма; оценить репликативную активность вируса в тканях; количественно определить концентрацию вируса в сыворотке крови; установить генотип вируса и вести наблюдение за изменчивостью HCV. Обнаружение в сыворотке крови РНК HCV является “золотым стандартом” диагностики, свидетельствующем о продолжающейся репликации HCV.

Анализ на генетический код в лаборатории «ЛИТЕХ»

• Полимераная цепная реакция (ПЦР) (выявление специфического фрагмента РНК вируса)
• Качественное определение HСV РНК.
• Количественное определение HСV РНК. Анализ проводится после положительного качественного исследования.
• Определение генотипа HCV. Анализ проводится после положительного качественного исследования

Сыворотка крови. Только в одноразовой пластиковой пробирке с плотно завинчивающейся крышкой.

Серологические исследования: определение специфических антител к вирусу гепатита С : Anti-HCV

Метод исследования: иммуноферментный анализ (ИФА). Материал для исследования: сыворотка крови. Только в одноразовой пластиковой пробирке с плотно завинчивающейся крышкой.

Сеть лабораторий «Литех» предлагает вам сдать анализ на определение генотипа вируса гепатита C по доступной цене. Чтобы определить, сколько полностью стоит проведение лабораторного исследования на генотипирование гепатита C, оформите заявку через форму на сайте или по телефону 8-800-700-45-82.

ЦИРКУЛИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНАЯ ФОРМА ВИРУСА ГЕПАТИТА С RF2k/1b: ПРОБЛЕМЫ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ | Дементьева

1. Моисеев С.В. Лечение хронического гепатита С: результаты рандомизированных контролируемых исследований // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии.- 2010.- Т. 2, № 4.- С. 91-97.

2. Кижло С.Н., Романова С.Ю. Сочетание противовирусной терапии хронического вирусного гепатита и ВИЧ-инфекции // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии.- 2011.- Т. 3, № 3.- С. 88-93.

3. Гущин А.Е., Носкова О.М., Шипулин Г.А. Разработка набора реагентов «Амплисенс HCV-генотип» для определения субтипов 1а, 1b, 2а, 3а вируса гепатита С // Вопросы вирусологии.- 2003.- Т. 48, № 3.- С. 45-48.

4. Миронов К.О., Гущин А.Е., Шипулина О.Ю., Шипулин Г.А. Разработка и клиническая апробация тест-системы «Амплисенс HCV-1/2/3» // Сборник трудов 6-й Всероссийской науч.-практ. конф. «Молекулярная диагностика-2007».- М., 2007.- Т. 1.- С. 260-265.

5. Ведерников В.Е., Иванов М.К., Трухина А.В., Кандрушин Е.В. Два новых диагностических набора: «РеалБест РНК ВГС» и «РеалБест РНК ВГС-генотип» // Информационный бюллетень «Новости «Вектор-Бест».- 2009.- Т. 52, № 2.- С. 2-8.

6. Martell M., Esteban J.I., Quer J., Genesca J., Weiner A., Esteban R., Guardia J., Gomez J. Hepatitis C virus (HCV) circulates as a population of different but closely related genomes: quasispecies nature of HCV genome distribution // J. Virol.- 1992.- Vol. 66, № 5.- P 3225-3229.

7. Smith D.B., Bukh J., Kuiken C., Muerhoff A.S., Rice C.M., Stapleton J.T., Simmonds P. Expanded classification of hepatitis C virus into 7 genotypes and 67 subtypes: updated criteria and genotype assignment web resource // Hepatology.- 2014.- Vol. 59, № 1.- P 318-327.

8. Kalinina O., Norder H., Mukomolov S., Magnius L.O. A natural intergenotypic recombinant of hepatitis C virus identified in St. Petersburg // J. Virol.- 2002.- Vol. 76, № 8.- P 4034-4043.

9. Simmonds P., Bukh J., Combet C., Deleage G., Enomoto N., Feinstone S., Halfon P., Inchauspe G., Kuiken C., Maertens G., Mizokami M., Murphy D.G., Okamoto H., Pawlotsky J.M., Penin F., Sablon E., Shin-IT., Stuyver L.J., Thiel H.J., Viazov S., Weiner A.J., Widell A. Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes // Hepatology.- 2005.- Vol. 42, № 4.- P 962-973.

10. Lee Y.M., Lin H.J., Chen Y.J., Lee C.M., Wang S.F., Chang K.Y., Chen T.L., Liu H.F., Chen Y.M. Molecular epidemiology of HCV genotypes among injection drug users in Taiwan: Full-length sequences of two new subtype 6w strains and a recombinant form_2b6w // J. Med. Virol.- 2010.- Vol. 82, № 1.- P 57-68.

11. Legrand-Abravanel F., Claudinon J., Nicot F., Dubois M., Chapuy-Regaud S., Sandres-Saune K., Pasquier C., Izopet J. New natural intergenotypic (2/5) recombinant of hepatitis C virus // J. Virol.- 2007.- Vol. 81, № 8.- P 4357-4362.

12. Noppornpanth S., Lien T.X., Poovorawan Y., Smits S.L., Osterhaus A.D., Haagmans B.L. Identification of a naturally occurring recombinant genotype 2/6 hepatitis C virus // J. Virol.- 2006.- Vol. 80, № 15.- P 7569-7577.

13. Bhattacharya D., Accola M.A., Ansari I.H., Striker R., Rehrauer W.M. Naturally occurring genotype 2b/1a hepatitis C virus in the United States // J. Virol.- 2011.- Vol. 8.- P 458.

14. Yokoyama K., Takahashi M., Nishizawa T., Nagashima S., Jirintai S., Yotsumoto S., Okamoto H., Momoi M.Y. Identification and characterization of a natural inter-genotypic (2b/1b) recombinant hepatitis C virus in Japan // Arch. Virol.- 2011.- Vol. 156, № 9.- P 1591-1601.

15. Kageyama S., Agdamag D.M., Alesna E.T., Leano P.S., Heredia A.M., Abellanosa-Tac-An I.P., Jereza L.D., Tanimoto T., Yamamura J., Ichimura H. A natural inter-genotypic (2b/1b) recombinant of hepatitis C virus in the Philippines // J. Med. Virol.- 2006.- Vol. 78, № 11.- P. 1423-1428.

16. Kalinina O., Jern C., Tallo T., Thcakharian V., Gusev D., Znoiko O., Isaguliants M., Mukomolov S., Norder H., Magnius L. Spread of the natural hepatitis C virus recombinant outside Russia // 12th International symposium on viral hepatitis and liver disease.- Paris, 2006.- P 189.

17. Kurbanov F., Tanaka Y., Avazova D., Khan A., Sugauchi F., Kan N., Kurbanova-Khudayberganova D., Khikmatullaeva A., Musabaev E., Mizokami M. Detection of hepatitis C virus natural recombinant RF1_2k/1b strain among intravenous drug users in Uzbekistan // Hepatol. Res. — 2008.- Vol. 38, № 5.- P. 457-464.

18. Moreau I., Hegarty S., Levis J., Sheehy P., Crosbie O., Kenny-Walsh E., Fanning L.J. Serendipitous identification of natural intergenotypic recombinants of hepatitis C in Ireland // J. Virol.- 2006.- Vol. 3.- P. 95.

19. Tallo T., Norder H., Tefanova V., Krispin T., Schmidt J., Ilmoja M., Orgulas K., Pruunsild K., Priimagi L., Magnius L.O. Genetic characterization of hepatitis C virus strains in Estonia: fluctuations in the predominating subtype with time // J. Med. Virol.- 2007.- Vol. 79, № 4.- P 374-382.

20. Demetriou V.L., Kyriakou E., Kostrikis L.G. Near-full genome characterisation of two natural intergenotypic 2k/1b recombinant hepatitis C virus isolates // Adv Virol. — 2011.- Vol. 2011.- P. 710438.

21. Morel V., Descamps V., Francois C., Fournier C., Brochot E., Capron D., Duverlie G., Castelain S. Emergence of a genomic variant of the recombinant 2k/1b strain during a mixed Hepatitis C infection: a case report // J. Clin. Virol.- 2010.- Vol. 47, № 4.- P. 382-386.

22. Karchava M., Waldenstrom J., Parker M., Hallack R., Sharvadze L., Gatserelia L., Chkhartishvili N., Dvali N., Dzigua L., Dolmazashvili E., Norder H., Tsertsvadze T. High incidence of the hepatitis C virus recombinant 2k/1b in Georgia: Recommendations for testing and treatment // Hepatol. Res.- 2015.

23. Raghwani J., ThomasX.V., Koekkoek S.M., Schinkel J., Molenkamp R., van de Laar T.J., Takebe Y., Tanaka Y., Mizokami M., Rambaut A., Pybus O.G. Origin and evolution of the unique hepatitis C virus circulating recombinant form 2k/1b // J. Virol.- 2012.- Vol. 86, № 4.- P 2212-2220.

24. Nakatani S.M., Santos C.A., Riediger I.N., Krieger M.A., Duarte C.A., do Carmo Debur M., Carrilho FJ., Ono S.K. Comparative performance evaluation of hepatitis C virus genotyping based on the 5’ untranslated region versus partial sequencing of the NS5B region of brazilian patients with chronic hepatitis C // J. Virol.- 2011.- Vol. 8.- P. 459.

25. Cai Q., Zhao Z., Liu Y., Shao X., Gao Z. Comparison of three different HCV genotyping methods: core, NS5B sequence analysis and line probe assay // Int. J. Mol. Med.- 2013.- Vol. 31, № 2.- P 347-352.

26. Larrat S., Poveda J.D., Coudret C., Fusillier K., Magnat N., Signori-Schmuck A., Thibault V., Morand P. Sequencing assays for failed genotyping with the versant hepatitis C virus genotype assay (LiPA), version 2.0 // J. Clin. Microbiol.- 2013.- Vol. 51, № 9.- P 2815-2821.

27. Quer J., Gregori J., Rodriguez-Frias F., Viladomiu L., Salmeron J., Ruiz-Extremera A., Quiles-Perez R., Moreno-Otero R., Lopez-Rodriguez R., Allende H., Romero-Gomez M., Guardia J., Esteban R., Garcia-Samaniego J., Forns X., Esteban J.I. High-resolution hepatitis C virus subtyping using NS5B deep sequencing and phylogeny, an alternative to current methods // J. Clin. Microbiol.- 2015.- Vol. 53, № 1.- P 219-226.

28. McCormick A.L., Macartney M.J., Abdi-Abshir I., Labbett W., Smith C., Irish D., Webster D.P., Haque T. Evaluation of sequencing of HCV core/E1, NS5A and NS5B as a genotype predictive tool in comparison with commercial assays targeting 5’UTR // J. Clin. Virol.- 2015.- Vol. 66.- P. 56-59.

29. Liu C.H., Liang C.C., Liu C.J., Lin C.L., Su T.H., Yang H.C., Chen P.J., Chen D.S., Kao J.H. Comparison of Abbott RealTime HCV Genotype II with Versant line probe assay 2.0 for hepatitis C virus genotyping // J. Clin. Microbiol.- 2015.- Vol. 53, № 5.- P. 1754-1757.

30. Vaghefi P., MarchadierE., Dussaix E., Roque-Afonso A.M. Hepatitis C virus genotyping: comparison of the Abbott RealTime HCV Genotype II assay and NS5B sequencing // Pathol. Biol.- 2010.- Vol. 58, № 2 — P. 175-178.

31. Gonzalez V., Gomes-Fernandes M., Bascunana E., Casanovas S., Saludes V., Jordana-Lluch E., Matas L., Ausina V., Martro E. Accuracy of a commercially available assay for HCV genotyping and subtyping in the clinical practice // J. Clin. Virol.- 2013.- Sep.- Vol. 58, № 1.- P 249-253.

32. Калинина О.В. Организация генома и география природного межгенотипного рекомбинанта вируса гепатита С RF1_2k/1b // Инфекция и иммунитет.- 2012.- Т. 2, № 4.- С. 677-686.

33. Николаева Л.И., Сапронов Г.В., Колотвин А.В., Самохвалов Е.И., Лейбман Е.А., Самоходская Л.М. Гепатит С при инфицировании рекомбинантной формой вируса RF2k/1b: течение и терапия // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2014. — № 3. — С. 9-15.

34. Калинина О.В., Дудина К.Р., Козина А.Н., Дмитриев А.В., Исагулянц М.Г., Знойко О.О. Межгенотипные рекомбинанты вируса гепатита С — природные модели для изучения молекулярно-генетических детерминант резистентности вируса к действию противовирусных препаратов // Трансляционная медицина.- 2014.- № 3.- С. 29-38.

35. European Association for the Study of the Liver. EASL recommendations on treatment of hepatitis C 2015 // Journal of Hepatology.- 2015.- Vol. 63.- P. 199-236.

36. Кравченко А.В., Куимова У.А., Ганкина Н.Ю., Канестри В.Г., Чуланов В.П. Предикторы устойчивого вирусологического ответа при терапии хронического гепатита пегилированным интерфероном и рибавирином у больных ВИЧ-инфекцией // Инфекционные болезни.- 2014.- Т. 12, № 2.- С. 30-34.

37. Hedskog C., Doehle B., Chodavarapu K., Gontcharova V., Crespo Garcia J., De Knegt R., Drenth J.P., McHutchison J.G., Brainard D., Stamm L.M., Miller M.D., Svarovskaia E., Mo H. Characterization of hepatitis C virus intergenotypic recombinant strains and associated virological response to sofosbuvir/ribavirin // Hepatology.- 2015.- Vol. 61, № 2.- P 471-480.

Определение генотипа вируса гепатита C (Hepatitis C virus) (с подтипами 1a, 1b, 2, 3a, 3b)

Стоматология для детей и взрослых: терапия, исправление прикуса, отбеливание и имплантация зубов, медицинское сопровождение иностранных граждан. Центр неврологии, гинекология и урология. Программы патронажа для детей.

*Цены, указанные на сайте, не являются публичной офертой. Стоимость услуг устанавливается и оплачивается согласно прейскуранту Клиники, действующему на момент оказания соответствующей услуги. С действующим прейскурантом Вы можете ознакомиться на стойке регистратуры, у администратора или по телефону 8 (831) 421-01-01.

Генотип 1b вируса гепатита C (HCV) демонстрирует более высокую генетическую изменчивость гипервариабельной области 1 (HVR1), чем генотип 3

Наше исследование было направлено на характеристику углубленной генетической изменчивости внутри хозяина генотипов 1b и 3 HCV, как на очень ранней стадии. фаза инфекции до сероконверсии, отражающая естественную сложность вируса при отсутствии гуморального давления и в группе серопозитивных, не получавших лечения хронически инфицированных пациентов. Уникальная возможность изучить очень ранние события, связанные с вирусом, была предоставлена ​​доступом к образцам от доноров с положительной РНК ВГС и отрицательной анти-ВГС.Такие образцы представляют собой очень раннюю стадию заражения и обнаруживаются с частотой 18,5 на 1 миллион пожертвований ¹⁹ .

Мы обнаружили, что на ранней стадии инфицирования количество вариантов HVR1 было значительно ниже у субъектов, инфицированных генотипом 3, чем у лиц, инфицированных генотипом 1b. Важно отметить, что наблюдаемый эффект не был связан ни с количеством считываний, ни с титром вируса. Кроме того, результаты анализа при двух разных порогах (0,5% и 1%) совпадали.Обнаруженные различия между молекулярными характеристиками HVR1 генотипа 1b и 3 HCV поразительны, и, насколько нам известно, ни одно из предыдущих исследований не рассматривало этот вопрос.

Чтобы определить, влияет ли серологический ответ на различия в вариабельности HVR1, аналогичное сравнение было проведено в группе серопозитивных, хронически инфицированных пациентов. Поскольку различия между двумя генотипами все еще сохранялись, похоже, что генотип 3 HVR1 демонстрирует более низкую эволюционную динамику, чем генотип 1b, на протяжении всего курса инфекции.Тем не менее, параметры вариабельности HVR1 были значительно выше при хронической инфекции по сравнению с ранней инфекцией, что согласуется с более ранними данными об эффекте «бутылочного горлышка» из-за избирательной передачи только некоторых вариантов HCV ^2,8,13 . Впоследствии происходит постепенное расширение популяции внутри хозяина, которое в конечном итоге может быть нарушено давлением окружающей среды или затратами на приспособленность вируса ^1,20 .

Важно отметить, что как при раннем, так и при хроническом заражении генотипом 3 наблюдалась другая частотная структура вариантов внутри хозяина, чем при инфицировании генотипом 1b, с более высоким вкладом частоты основного (i.е. самый частый) вариант. Это означает, что генотип 3 имеет более низкую способность образовывать варианты с меньшей частотой, что может обеспечить преимущество в приспособленности под давлением окружающей среды, например, со стороны иммунной системы или лечения. Можно предположить, что именно по этой причине инфекция генотипа 3 характеризуется лучшим ответом на иммуномодулирующее лечение интерфероном альфа и рибавирином ²¹ . Различия в генетической изменчивости HVR1 также могут иметь клиническое значение для естественного течения инфекции.Некоторые наблюдения предполагают, что, хотя генотип 3 отвечает за большинство внебольничных инфекций ВГС, он часто элиминируется на ранней стадии инфекции, и его потенциал развития хронической инфекции ниже по сравнению с другими генотипами ВГС, особенно 1b ^19,22 . В исследовании Hwang et al ., В котором участвовали 67 пациентов с острым посттрансфузионным гепатитом C, у пациентов с генотипом 1b была большая вероятность развития хронического гепатита, чем у пациентов, инфицированных другими генотипами (89.7% против 64,3%; р = 0,019) ²³ . Аналогичным образом, Amoroso et al . показали, что скорость прогрессирования в хроническую форму составляла 92% у пациентов, подвергшихся воздействию генотипа 1b HCV, по сравнению с 50% у пациентов, подвергшихся воздействию генотипа 3 ⁶ . Эти данные свидетельствуют о том, что генотип ВГС может играть важную роль в клиническом течении инфекции после контакта с ВГС. Более низкая генетическая изменчивость генотипа 3, наблюдаемая нами во время серонегативной ранней фазы инфекции, может быть связана с более высокой вероятностью спонтанной элиминации вируса, поскольку иммунная система может быть более эффективной при нацеливании на «однородную» вирусную популяцию ³ .

Хотя NGS является чрезвычайно полезным инструментом для оценки генетического разнообразия, он очень подвержен ошибкам при секвенировании. Из-за этого мы провели обширную оценку присущей необработанной ошибки секвенирования всей процедуры с использованием вставки плазмиды HVR1 в качестве шаблона ²⁴ , применили последующую коррекцию ошибок и частоту отсечки. Важно отметить, что различия наблюдались при двух разных пороговых значениях (т.е. 0,5% и 1%).

Следует отметить, что, хотя мы обнаружили очевидные различия между вариабельностью генотипа 1b и генотипа 3, эти наблюдения ограничиваются иммунологически важными, но единственными и небольшими областями генома и могут не распространяться на другие гипервариабельные области ВГС, такие как HVR2 и HVR3 ²⁵ .Примечательно, что новые гипервариабельные области HVR495 и HVR575, как было обнаружено, присутствуют в генотипе 3, но не в геномах генотипов 1a, 1b, 2a или 6a ²⁶ . Поскольку они также подвержены положительному иммунному отбору, необходимы дальнейшие исследования для определения характеристик их изменчивости при ранней и хронической инфекции.

Таким образом, параметры генетической изменчивости HVR1 были ниже у пациентов, инфицированных генотипом 3, чем у пациентов, инфицированных генотипом 1b. Учитывая, что эти различия могут наблюдаться как при острой, так и при хронической инфекции, кажется, что это явление не связано с иммунным давлением, а скорее может отражать врожденное свойство определенных вирусных генотипов.

Различия в вирусной динамике между генотипами 1 и 2 вируса гепатита С | Журнал инфекционных болезней

Абстрактные

Многие исследования показали, что пациенты, инфицированные вирусом гепатита C (HCV) генотипа 2, имеют лучший ответ на лечение интерфероном (IFN) — α , чем пациенты с генотипом 1; однако механизмы, ответственные за это различие, не поняты. В этом исследовании вирусная динамика во время лечения индукцией высоких доз IFN сравнивалась между генотипами.Пациенты в каждой группе получали 10 МЕ IFN- α 2b в течение 14 дней, и часто определяли уровни РНК HCV. Была проведена нелинейная подгонка, как индивидуально для каждого пациента, так и с использованием подхода со смешанными эффектами, вирусных кинетических данных к математической модели воздействия IFN на инфекцию HCV. Противовирусная эффективность IFN в блокировании продукции вируса, скорость клиренса свободного вириона и скорость гибели клеток, инфицированных HCV, были значительно выше для пациентов с генотипом 2, чем для пациентов с генотипом 1.Таким образом, лучший ответ пациентов, инфицированных генотипом 2 HCV, является многофакторным. Это первое обнаружение различий в вирусной динамике между подтипами одного и того же вируса и демонстрирует важность специфических для подтипов взаимодействий вирус-хозяин-лекарство.

Хроническая инфекция вируса гепатита С (ВГС) вызывает вялотекущее заболевание печени, которое через 1–4 десятилетия может прогрессировать до цирроза, декомпенсированного заболевания печени и гепатоцеллюлярной карциномы [1, 2]. Он имеет высокую распространенность, от 1% до 3%, во всем мире, и, несмотря на снижение числа новых случаев инфицирования ВГС, было подсчитано, что потребность в трансплантации печени для лечения ВГС из-за его исходов возрастет с 5-7 до 7. раза в следующие 20 лет, если терапия не станет более эффективной [3].Интерферон (IFN) — α был основой терапии ВГС, хотя устойчивый вирусологический клиренс наблюдается только у 7–20% пациентов, пролеченных в течение 1 года [4]. Добавление нуклеотидного аналога рибавирина к терапии IFN увеличивало устойчивый вирусный ответ до 30-40% [5, 6]. Было показано, что терапевтический ответ как на монотерапию IFN [7, 8], так и на комбинированную терапию [5, 6] существенно зависит от генотипа HCV, инфицирующего пациента. Например, устойчивый вирусологический ответ наблюдается у 65% пациентов, получающих IFN- α 2b и рибавирин и инфицированных вирусными генотипами 2 и 3, но только у 30% пациентов, инфицированных генотипом 1 [5, 6].Причина столь резких различий в скорости вирусного ответа между этими близкородственными штаммами вируса неизвестна.

Мы недавно описали раннее снижение вирусной кинетики в ответ на ежедневную терапию высокими дозами IFN у пациентов, инфицированных HCV генотипов la и 1b, и показали, что уровни вируса снижаются двухфазным образом [9–11]. Первая фаза снижения является быстрой, составляя 0,5–2 log снижения уровней РНК ВГС в течение 48 часов после начала терапии, при этом степень снижения сильно зависит от дозы.После этого быстрого снижения следует более медленная вторая фаза снижения РНК HCV. Показано, что скорость снижения уровня вируса во время этой фазы сильно варьируется между пациентами и не зависит от дозы. Кроме того, наклон второй фазы, который, как мы обнаружили, обратно коррелирует с исходной вирусной нагрузкой, является хорошим предиктором того, что вирус в сыворотке крови станет неопределяемым после 3 месяцев терапии [9]. Используя математические модели, мы показали, что двухфазное снижение можно объяснить тем, что IFN частично блокирует продукцию и / или высвобождение вирионов [9].Наклон первой фазы был отнесен к клиренсу свободных вирионов, тогда как наклон второй фазы можно отнести к потере инфицированных HCV клеток, причем оба наклона зависят также от эффективности ИФН в блокировании продукции. Блокирование инфекции de novo с помощью IFN является возможным, но не необходимым дополнительным эффектом и не меняет значительно двухфазное снижение, если основным эффектом IFN является блокирование продукции [9].

В настоящем исследовании, используя те же математические принципы, мы анализируем и сравниваем раннюю вирусную динамику после начала терапии IFN (10 МЕ ежедневно) у пациентов, инфицированных генотипом 1, с таковой у пациентов, инфицированных вирусом генотипа 2.Мы показываем, что больший вирусный ответ у пациентов, инфицированных генотипом 2, обусловлен множеством факторов, включая более высокую эффективность лекарственного средства, более быструю скорость выведения свободного вириона и, возможно, усиленный иммунологический ответ. Это первое обнаружение различий в вирусной динамике между двумя подтипами одного и того же вируса.

Методы

Пациенты

Пациентов, обследованных в Центре печени Университета Иллинойса, Чикаго, у которых ВГС подтвержден положительным уровнем РНК ВГС и повышенным уровнем аминотрансаминазы, попросили пройти скрининг для участия в исследовании.Исследование было одобрено Наблюдательным советом Института Иллинойса и Научным комитетом по клиническим ресурсам. Для включения в исследование пациенты должны были иметь инфекцию либо генотипа la или 1b, либо генотипа 2a или 2b, диагностированного с использованием метода генотипирования Okamoto et al. [12] в соответствии с номенклатурой генотипов Simmonds et al. [13]. Далее мы не разделяли пациентов на подтипы каждого генотипа, потому что в другом месте [9] мы не обнаружили различий между подтипами (1a и 1b) генотипа 1, а здесь 8/9 пациентов с генотипом 2 относятся к подтипу 2b.Пациенты имели полный и физический анамнез и были исключены, если у них были доказательства декомпенсированного заболевания печени или в анамнезе продолжающееся употребление алкоголя или запрещенных наркотиков. Использовались другие стандартные критерии включения и исключения для терапии ИФН [9]. Если пациенты не проходили биопсию печени в течение 2 лет до исследования, их просили пройти чрескожную биопсию как часть стандартной практики. Эти биопсии и биопсии, выполненные за последние 2 года, были слепо рассмотрено одним из авторов (T.J.L.) и оценивали гистологическую активность с использованием балльной системы Knodell et al. [14]. Пациенты с инфекцией генотипа 1 или генотипа 2, включенные в это исследование, были включены в тот же период времени, и анализы, использованные для измерения уровней РНК HCV, были такими же. Результаты для пациентов, инфицированных генотипом 1, были опубликованы в другом месте [9].

Протокол и образцы

пациентов были госпитализированы в Клинический ресурсный центр, и был установлен небольшой интеркатетер для взятия крови.В 8 часов утра пациентам подкожно вводили 10 МЕ IFN- α 2b (Schering Plough, Кенилворт, Нью-Джерси). Кровь брали через 0, 2, 4, 7, 10, 14, 19 и 24 ч после первой инъекции. Сыворотку отделяли в течение 4 часов после венепункции, разделяли на аликвоты и хранили при -70 ° C. В 8:00 каждого из следующих 13 дней пациенты вводили себе 10 МЕ IFN. На второй день кровь забирали через 5, 10 и 24 ч, а также на 3-5, 7, 9, 11, 12 и 14 дни до введения IFN. Через 14 дней пациенты получали поддерживающую терапию 5 MU IFN ежедневно в течение 6 месяцев (результаты не показаны).

Количественное определение РНК HCV

Уровни

РНК HCV определяли количественно методом разветвленной ДНК (Quantiplex 2.0, Chiron, Emoryville, CA) и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Superquant, Национальный генетический институт, Лос-Анджелес). Критерии использования результатов каждого из этих анализов применялись, как описано в другом месте [9].

Математическая модель

Данные были проанализированы с использованием ранее опубликованной нами математической модели влияния ИФН на динамику инфицирования ВГС [9].Дифференциальные уравнения модели: где T представляет количество клеток-мишеней, I представляет количество продуктивно инфицированных клеток, а V представляет собой вирусную нагрузку. Клетки-мишени продуцируются со скоростью с и умирают с константой смертности d . Клетки инфицируются с константой скорости заражения de novo β и после заражения умирают с константой скорости δ8 . Вирионы гепатита C продуцируются инфицированными клетками со средней скоростью p вирионов на клетку в день и очищаются с константой скорости клиренса c .Предполагается, что IFN в этой модели снижает продукцию вирионов из инфицированных клеток на фракцию (1 — ε ), но также может снижать de novo инфицирование клеток-мишеней на фактор (1 — η ). Перед терапией IFN ε = η = 0. Предполагается, что терапия IFN вступит в силу, 0 ε ⩽ 1, при t = t ₀ , где t = 0 — время первой инъекции и t ₀ — задержка, возможно, из-за фармакокинетического запаздывания.В предположении установившегося состояния предварительной обработки решение уравнений (2) и (3) с постоянной T : где; .
В другом месте [9] было показано, что это решение дает двухфазное снижение, подобное снижению ВГС при лечении IFN, когда основным эффектом интерферона является , частично блокирование продукции вириона (0 ε η ⩽ 1, кинетика не Здесь, в качестве приближения, мы предполагаем, что η = 0, но мы проверили, что результаты, представленные здесь в отношении кинетических различий между генотипами 1 и 2, не изменятся, если мы предположим, что 0 уравнение (3), где I (t) предполагается постоянным в течение 2 дней, является и может использоваться для согласования снижения вирусной активности, когда доступны только краткосрочные данные, или в качестве первого шага в согласовании полного набора данных с уравнение (4), если в течение первых нескольких дней будет достаточно точек данных.

Статистический анализ

Точный критерий Фишера (таблицы 2 × 2) и критерий × ² (таблицы N × N ) были использованы для определения статистической значимости распределения категориальных переменных между группами. Непараметрический критерий суммы рангов Вилкоксона использовался для определения статистической значимости различий в непрерывных переменных между различными группами. Корреляцию между переменными или между переменными и исходными значениями оценивали с помощью непараметрического критерия Спирмена.Значимость установлена ​​на p <03.

Подгонка нелинейных данных

Для оценки кинетических параметров вируса ВГС для каждого пациента логарифм уравнений (4) или (5) был подогнан к логарифму данных вирусной нагрузки нелинейным методом наименьших квадратов с использованием подпрограммы DNLS1 из Общей библиотеки программного обеспечения Лос-Аламоса. , который основан на конечно-разностном алгоритме Левенберга-Марквардта [15]. Стандартные ошибки рассчитывались методом бутстрапа, при котором эксперименты моделировались 100 раз.

Подход со смешанными эффектами [16] также использовался для нелинейной подгонки модели к данным вирусной нагрузки с 0–2 или 0–14 дней терапии. В этом подходе, который является стандартным статистическим методом анализа фармакокинетических и других данных от нескольких субъектов, предполагается, что каждый субъект имеет специфичные для пациента динамические параметры ( V ₀ , t ₀ , c , δ, и е) нормально распределенные вокруг средних значений, которые могут быть разными для каждой группы пациентов, в зависимости от генотипа HCV или дозы IFN.В отличие от обычного нелинейного регрессионного анализа, где параметры оцениваются по данным каждого субъекта отдельно, а затем суммируются [9], в этом подходе данные от всех субъектов объединяются для оценки средних значений совокупности непосредственно с учетом межпредметных вариаций. Это позволяет тестировать различия в средних значениях (например, из-за генотипа ВГС) на основе всех данных, а также учитывать возможные различия из-за дозы и других факторов. Логарифм уравнений (4) или (5) был подогнан к логарифму данных вирусной нагрузки для всех оцениваемых субъектов с использованием стандартного алгоритма Ньютона-Рафсона для нелинейного анализа смешанной модели, реализованного в функции NLME в S-PLUS [ 17] статистический программный комплекс.Стандартные ошибки и статистические данные тестов для генотипа и эффектов дозы на основе всех данных субъектов были рассчитаны с помощью программного обеспечения с помощью стандартной статистической теории.

Результаты

В таблице 1 приведены клинические демографические данные, гистологические данные, исходный уровень аланинаминотрансферазы (АЛТ) и исходная вирусная нагрузка 8 пациентов, инфицированных вирусным генотипом 1, и 9 пациентов, инфицированных генотипом 2. Не было различий между двумя группами в клинические и демографические особенности, гистологическая активность или исходная вирусная нагрузка (медиана, 9.7 × 10 ⁶ имп / мл, с диапазоном 1,0 × 10 ⁶ -5,9 × 10 ⁷ для пациентов с генотипом 1 и медиана, 4,0 × 10 ⁶ , с диапазоном 4,0 × 10 ⁵ -2,7 × 10 ⁷ для генотипа 2). Хотя исходная АЛТ была несколько выше у пациентов, инфицированных вирусом генотипа 2 (медиана 92; диапазон 54–242), чем генотип 1 (медиана 73; диапазон 31–157), это не было статистически значимым.

Таблица 1

Демографические и исходные характеристики пациентов.

Таблица 1

Демографические и исходные характеристики пациентов.

После начала лечения интерфероном, с ежедневными инъекциями 10 МЕ в течение 14 дней, вирусная кинетика в обеих группах пациентов у большинства пациентов следовала двухфазному снижению, за исключением 2 пациентов, у которых был рецидив после 1 дня терапии и 4 пациенты, прервавшие лечение в течение первой недели. Среднее снижение вирусной нагрузки было более быстрым и значительным у пациентов с генотипом 2 по сравнению с пациентами с генотипом 1 (рис. 1, вверху).

Рисунок 1

Top , Среднее и SD логарифмического снижения вирусной нагрузки в течение первых 14 дней терапии интерфероном- α для пациентов, инфицированных вирусом гепатита С (HCV) генотипа 1 (■) по сравнению с генотипом 2 (●) . Внизу , данные о вирусной нагрузке (кружки) и наилучшее соответствие модели (линии) у 3 репрезентативных пациентов с генотипом 2. Пациент 4E прекратил лечение на 3-й день (данные соответствуют уравнению [5]). Нагрузка Viras для пациента 4I была ниже уровня обнаружения на 10-й день (данные соответствуют уравнению [4]).

Рисунок 1

Top , Среднее и SD логарифмического снижения вирусной нагрузки в течение первых 14 дней терапии интерфероном- α для пациентов, инфицированных вирусом гепатита С (HCV) генотипа 1 (■) по сравнению с генотипом 2 (● ). Внизу , данные о вирусной нагрузке (кружки) и наилучшее соответствие модели (линии) у 3 репрезентативных пациентов с генотипом 2. Пациент 4E прекратил лечение на 3-й день (данные соответствуют уравнению [5]). Нагрузка Viras для пациента 4I была ниже уровня обнаружения на 10-й день (данные соответствуют уравнению [4]).

Нелинейная аппроксимация (с использованием уравнения [5]; см. Методы) вирусных кинетических данных сначала была выполнена для каждого отдельного пациента в течение 0–2 дней лечения (рисунок 1, внизу), чтобы получить оценки начальной вирусной нагрузки ( V ₀ ), задержку действия IFN ( t ₀ ), эффективность IFN в блокировании продукции вируса ( ε ) и константу скорости клиренса свободного вириона (c) . Результаты представлены в таблице 2. Начальная вирусная нагрузка и задержка до того, как уровни вируса начали падать, существенно не различались между генотипами; однако средняя эффективность ИФН в блокировании продукции ВГС была значительно выше у пациентов с генотипом 2, чем у пациентов с генотипом 1 (ε = 99.7% ± 0,4% по сравнению с ε = 95,3% ± 4,0%, P = 0,003; рисунок 2, вверху), что приводит к значительно большему среднему снижению вирусной нагрузки в конце 48 часов для группы с генотипом 2 (2,95 log копий / мл) по сравнению с группой с генотипом 1 (1,65 log копий / мл; рисунок 1, Вверх). Кроме того, скорость клиренса свободного вириона (c) была значительно выше (рисунок 2, вверху) для пациентов с генотипом 2 ( t _1/2 = 2,0 ± 0,5 ч), чем для пациентов с генотипом 1 ( t _1/2 = 3.0 ± 1,0 ч; P = 0,03). Не было обнаружено корреляции между ε и c только для пациентов с генотипом 2 или для полного набора [9] ( N = 23) только пациентов с генотипом 1, хотя и c и ε повышены. для генотипа 2 по сравнению с пациентами с генотипом 1.

Таблица 2

Таблица 2

Рисунок 2

Различия между кинетическими параметрами у пациентов, инфицированных вирусом гепатита С (HCV) генотипа 1 (■) и генотипа 2 (●). Top , Эффективность интерферона (IFN) — α в блокировании продукции вируса ( ε ) и константа скорости клиренса свободного вириона (c). Внизу , график смертности инфицированных клеток (5) в зависимости от базовой вирусной нагрузки ( V, ₀ ).

Рисунок 2

Различия между кинетическими параметрами у пациентов, инфицированных вирусом гепатита С (HCV) генотипа 1 (■) и генотипа 2 (●). Top , Эффективность интерферона (IFN) — α в блокировании продукции вируса ( ε ) и константа скорости клиренса свободного вириона (c).Внизу , график смертности инфицированных клеток (5) в зависимости от базовой вирусной нагрузки ( V, ₀ ).

Затем мы подобрали вирусные кинетические данные (используя уравнение [4]; см. Методы) в течение первых 14 дней лечения (рисунок 1, внизу), чтобы оценить уровень смертности инфицированных клеток ( δ ), который составляет основной фактор, определяющий наклон второй фазы (см. результаты в таблице 2). Значение δ не могло быть оценено для пациентов, которые преждевременно прекратили терапию или у которых вирусная нагрузка упала ниже обнаруживаемой к 3–6 дням лечения.Значения, оцененные для V ₀ , t ₀ , ε и c из подбора данных для дней 0–2, были использованы для оценки δ при подборе данных за дни. 0–14. Те же оценки параметров в пределах ошибок были найдены, если уравнение (4) использовалось для оценки всех 5 параметров одновременно с использованием 14-дневных данных, но в некоторых случаях алгоритм нелинейной аппроксимации не сходился. Хотя количество пациентов, для которых можно оценить δ или наклон второй фазы, невелико ( N = 5 и 4 для генотипов 1 и 2, соответственно), мы тем не менее обнаружили, что пациенты с генотипом 2 имеют значительно более высокая смертность инфицированных клеток, чем у пациентов с генотипом 1 ( t _1/2 = 3.2 ± 1,7 суток и т _1/2 = 8,7 ± 5,2 суток соответственно; P = 0,03). Показатели смертности инфицированных клеток для этих 9 пациентов удовлетворяют обратной корреляции с исходной вирусной нагрузкой ( R = -,8; P = 0,009; рисунок 2, внизу), которую мы наблюдали в других местах для 23 пациентов с генотипом 1 [9 ], но их ограниченное количество не позволяет нам независимо проверить эту корреляцию для генотипа 2.

Чтобы дополнительно убедиться, что различия между генотипами статистически значимы, мы также использовали нелинейную модель смешанных эффектов [16] для анализа полного генотипа. 1 (23 пациента [9], получавших 5, 10 или 15 МЕ IFN), а также данные по генотипу 2, представленные здесь.Средние значения параметров, оцененные для каждой группы генотипов (генотип 1: t ₀ = 7,7 ± 0,7 ч, ε = 97,0% ± 4,0%, c = 4,5 ± 2,0 дня ⁻¹ , δ = 0,20 ± 0,15 дня ^-1 ; генотип 2: t ₀ = 7,2 ± 1,0 ч, ε = 99,6% ± 0,7%, c = 8,6 ± 0,9 дня ^{— 1} , δ = 0,36 ± 0,25 дня ^-1 ) согласуются в пределах стандартных отклонений с данными, полученными путем подбора отдельных пациентов (таблица 2).

Анализ смешанных эффектов позволяет нам тестировать с использованием многопараметрического подхода комбинированное влияние генотипа и дозы на каждый параметр модели, принимая во внимание случайные эффекты для каждого пациента. Мы обнаружили, что генотип является очень значимым фактором ( P <0,001) как для эффективности IFN, так и для скорости клиренса свободного вириона, и что он также влияет на скорость гибели инфицированных клеток, но с более низкой степенью значимости ( P =. 02). Кроме того, модель смешанных эффектов подтвердила наш результат [9], согласно которому доза ИФН в 5 МЕ дает значительно ( P <.001) более низкая блокирующая эффективность, чем дозы 10 или 15 МЕ (данные не показаны).

Наконец, доля пациентов, у которых уровень вируса был ниже обнаруживаемого (<100 копий / мл) в течение 14 дней индукционной терапии, значительно ( P = 0,03) выше в группе с генотипом 2 (4/5 пациентов. кто завершил 14 дней лечения) по сравнению с группой генотипа 1 (1/7). В группе с генотипом 2 4/9 пациентов прекратили терапию самостоятельно через 3–6 дней лечения, но только 1/8 пациентов с генотипом 1, получавших ту же дозу IFN, досрочно прекратили терапию.Пациенты, которые прекратили терапию, имели сильный ранний ответ с логарифмическим снижением вирусной нагрузки на 2–4 в течение первых 48 часов лечения и признаками очень быстрого наклона второй фазы (например, пациенты 4C и 4E имели самые сильные ответы в нашем исследовании ; рисунок 1, внизу).

Обсуждение

Ряд контролируемых клинических исследований продемонстрировали, что устойчивый вирусологический ответ на монотерапию ИФН или комбинированную терапию ИФН-рибавирин в 2–3 раза выше у пациентов, инфицированных генотипом 2 ВГС, по сравнению с пациентами, инфицированными генотипом 1 [5–8 ].Это справедливо как для пациентов, ранее не получавших IFN, так и для пациентов с рецидивом, получавших IFN [18]. Более того, лечение пациентов с генотипом 2 в течение 24 или 48 недель дает такой же долгосрочный ответ, тогда как для пациентов, инфицированных генотипом 1, частота ответа увеличивается через 48 недель лечения [5, 6]. Причины этих различий в ответе на комбинированную терапию ИФН и рибавирином неизвестны и могут включать как хозяйские, так и вирусные факторы. Другие факторы хозяина, которые были связаны с улучшенным ответом на лечение, включают возраст [6, 7], пол [6, 7], степень поражения печени [19] и расовую принадлежность [20].В этом исследовании ни один из этих факторов существенно не отличался между группами пациентов, инфицированных генотипами 1 и 2.

Здесь мы исследовали, различалась ли ранняя вирусная кинетика в ответ на лечение IFN у пациентов, инфицированных генотипами 1 и 2. Обе группы ответили. двухфазным образом, с начальным быстрым снижением уровня ВГС в сыворотке с последующим более медленным снижением во второй фазе. Однако у пациентов с генотипом 2 степень снижения во время первой фазы была значительно больше, чем у пациентов с генотипом 1.Это различие можно частично объяснить большей эффективностью ИФН в блокировании продукции вирионов ВГС при инфекции генотипа 2. Кроме того, более высокая скорость снижения во время первой фазы у пациентов с генотипом 2 также отражала более высокую скорость клиренса свободного вириона. Наконец, наклон спада во время второй фазы также был значительно быстрее у пациентов, инфицированных генотипом 2, хотя количество пациентов, для которых мы могли оценить этот наклон, было небольшим. Аналогичный анализ, проведенный в другом исследовании с большим числом пациентов, но менее частым отбором образцов, также показывает значительно более быстрый наклон второй фазы у пациентов с генотипом 2 (A.Neumann, R. Reddy, T. Layden и J. Poulakos, неопубликованные данные). Это различие в наклоне второй фазы снижения объясняется различиями в вероятной иммуноопосредованной смертности клеток, инфицированных вирусом гепатита С [9].

Каковы возможные механизмы, лежащие в основе наблюдаемых различий в кинетике? В некоторых исследованиях [21–23] было показано, что ответ на IFN при инфекции генотипа 1b коррелирует либо с числом аминокислотных изменений в кодонах 2209–2248, области, определяющей чувствительность к интерферону (ISDR) неструктурного белка 5A (NS5A). ) или с конкретными мутациями в ISDR.Кроме того, недавно было показано, что у пациентов, инфицированных генотипом 2a HCV, большое количество мутаций в соответствующих ISDR (кодоны 2163–2228) связано с более высокой скоростью ответа на лечение IFN [24]. Предлагаемый механизм этой корреляции относится к исследованиям, демонстрирующим, что белок NS5A из ISDR вируса дикого типа генотипа la и lb может образовывать комплекс с РНК-зависимой протеинкиназой (PKR) и уменьшать его способность ингибировать трансляцию вирусного белка [25, 26 ]. Большое количество аминокислотных изменений в ISDR дикого типа делает HCV более чувствительным к IFN.Таким образом, если ISDR генотипа 2 имеет больше мутаций или если его мутации вызывают меньшую устойчивость к IFN, чем в генотипе 1, то различия между генотипами, которые мы наблюдаем в s , можно объяснить. Однако существует ряд исследований, демонстрирующих отсутствие корреляции между ответом на IFN и структурой NS5A у вируса генотипа 1 [27–29]. Таким образом, связь между мутациями в ISDR, генотипе и эффективностью IFN в блокировании продукции требует дальнейшего изучения.

Другое возможное объяснение различий в эффективности блокирования IFN между генотипами связано с гликопротеином второй оболочки HCV (E2), последовательность которого значительно варьируется между вирусными штаммами.E2 имеет относительно консервативную 12-аминокислотную последовательность из большинства вирусных изолятов, аналогичную сайту фосфорилирования PKR и сайту фосфорилирования фактора инициации трансляции eIF2 α [30]. Было обнаружено [30], что эта 12-аминокислотная последовательность в вирусе генотипов 1a и 1b больше напоминает домен гомологии PKR-eIF2 α , чем менее устойчивые к IFN штаммы вируса, генотипы 2 и 3. Авторы продемонстрировали, что белки E2 генотипа 1a и 1b были способны ингибировать активность PKR in vitro и ее влияние на клеточную функцию и рост.Мутации в последовательности E2, имитирующие последовательность E2 в генотипе 2, предотвращали это ингибирование [30]. Наши результаты, демонстрирующие значительно большую степень эффективности интерферона в блокировании продукции вирионов у вируса генотипа 2 по сравнению с вирусом генотипа 1, решительно подтверждают предположение о том, что HCV генотипа 1 более способен противодействовать эффектам IFN на вирусную трансляцию. Оба генетических различия между генотипами, в NS5A и E2, могут привести к снижению эффективности IFN.

Более быстрое выведение вируса HCV генотипа 2 в течение первых 48 часов лечения (первая фаза) было связано не только с различием в эффективности IFN, но и с более высокой скоростью выведения свободного вириона. Эта скорость клиренса, которая отражает период полужизни вирионов в сыворотке, может быть увеличена за счет опосредованного антителами клиренса вируса в дополнение к внутреннему неспецифическому клиренсу вирионов в организме. Действительно, ряд исследований [31–33] показал, что антительный ответ на гипервариабельный участок 1 (HVR-1) гликопротеина E2 оболочки ВГС был значительно более интенсивным и частым у субъектов, инфицированных генотипом 2, по сравнению с пациентами с генотипом 1. .Кроме того, более быстрое изменение вирусных последовательностей HVR-1 у пациентов с генотипом 2 по сравнению с генотипом 1 [34] также предполагает более сильное иммунное давление антител на вирус генотипа 2.

Наконец, вторая фаза снижения уровня вируса была значительно быстрее у пациентов, инфицированных генотипом 2, по сравнению с пациентами с генотипом 1. Было показано, что этот наклон снижения уровня вируса широко варьирует у пациентов, инфицированных вирусом генотипа 1, и является лучшим предиктором раннего вирусный клиренс [9]. Более быстрое снижение уровня вируса во второй фазе, скорее всего, отражает большую степень иммуноопосредованного распознавания и уничтожения клеток, инфицированных HCV.Действительно, было обнаружено [35], что специфический пролиферативный ответ против HCV клеток CD4 был значительно сильнее и сильнее усиливался при терапии IFN у пациентов, инфицированных генотипом 2, по сравнению с пациентами с генотипом 1. Независимо от того, произойдет ли большее уничтожение клеток, инфицированных генотипом 2, потребуется более тщательное сравнение ответа CTL у пациентов, инфицированных генотипом 2 и генотипом 1.

Другая гипотеза о лучшем ответе на лечение пациентов, инфицированных генотипом 2 ВГС, заключается в том, что репликация этого генотипа происходит медленнее, чем репликация генотипа 1.Однако из представленных здесь результатов нет никаких доказательств этого. В нашем исследовании продукция вирионов (оцениваемая здесь как исходная вирусная нагрузка, умноженная на скорость выведения вирионов) у пациентов с генотипом 2 не является значительно быстрее или медленнее, потому что мы обнаружили, что у пациентов с генотипом 2 скорость выведения вируса выше, но несколько снижена исходная вирусная нагрузка. Тем не менее, в исследовании [36], в котором анализируются различия в исходной вирусной нагрузке между генотипами HCV с большим количеством пациентов, было обнаружено, что пациенты с генотипом 2 имеют значительно более низкие вирусные нагрузки, чем пациенты с генотипом 1.Большое исследование с частой кинетикой ВГС генотипа 2 во время лечения или после его прекращения необходимо для определения возможной разницы в скорости репликации между генотипами. Также интересно отметить, что HCV генотипа 2, как было обнаружено, имеет значительно более низкие уровни как минус-цепи, так и геномной РНК в печени [37]. Однако в этом исследовании пациенты, инфицированные генотипом 2, имели базовую вирусную нагрузку в плазме, сравнимую с таковой у пациентов с генотипом 1, независимо от вирусной нагрузки в печени.Таким образом, снова нельзя ответить на вопрос о различиях в скорости репликации между генотипами.

Текущие результаты свидетельствуют о том, что лучший ответ на IFN у пациентов, инфицированных генотипом 2, является многофакторным, что отражает различия в способности IFN ингибировать продукцию вируса и различия в клиренсе вирионов и удалении инфицированных клеток, что, возможно, отражает различия как в гуморальном, так и в гуморальном уровнях. клеточный иммунный ответ на вирус. Это первое открытие различий в вирусной динамике между подтипами одного и того же вируса и показывает важность специфичных для подтипов взаимодействий между вирусом, хозяином и лекарством, используемым для лечения.Клиническое значение имеет наш вывод о том, что прогностическая ценность генотипа HCV для успеха лечения [38] может коррелировать с различиями в ранней вирусной кинетике, наблюдаемыми между группами пациентов, инфицированных разными генотипами. Хотя более быстрый распад вируса генотипа 2 характеризует средний ответ в этой группе, он наблюдается не для всех пациентов с генотипом 2. С другой стороны, более быстрое распад вируса на ранней стадии лечения коррелирует с вирусным негативом через 12 недель [9], а также с окончанием лечения и устойчивым вирусологическим ответом [39].Таким образом, анализ ранней вирусной кинетики может иметь важное значение, отдельно или вместе с исходной вирусной нагрузкой и генотипом ВГС, для лучшего прогнозирования ответа на терапию.

Благодарности

Мы благодарим пациентов за участие в исследовании и Б. Гольдштейна за использование его пакета нелинейной подгонки. Часть этой работы была выполнена под эгидой Министерства энергетики США.

Список литературы

1..

Эпидемиология гепатита С

,

Гепатология

,

1997

, т.

26

Дополнение 1

(стр.

S62

—

5

) 2.,,,.

Клинические исходы после гемотрансфузионного гепатита C

,

N Engl J Med

,

1995

, vol.

332

(стр.

1463

—

6

) 3.,,,.

Прогнозирование будущего бремени гепатита С в здравоохранении в США [аннотация]

,

Hepatology

,

1998

, vol.

28

pt 2

Suppl 4

pg.

99

4.

Конференция по разработке консенсуса национальных институтов здравоохранения

Заявление группы экспертов по развитию консенсуса национальных институтов здравоохранения: управление гепатитом C

,

Hepatology

,

1997

, vol.

26

Дополнение 1

(стр.

2

—

10

) 5.,,, Et al.

Интерферон альфа-2b отдельно или в комбинации с рибавирином в качестве начального лечения хронического гепатита C

,

N Engl J Med

,

1998

, vol.

339

(стр.

1485

—

92

) 6.,,, Et al.

Рандомизированное испытание интерферона альфа-2b плюс рибавирин в течение 48 недель или в течение 24 недель по сравнению с интерфероном альфа-2b плюс плацебо в течение 48 недель для лечения хронической инфекции вируса гепатита C: Международная группа интервенционной терапии гепатита

,

Lancet

,

1998

, т.

352

(стр.

1426

—

32

) 7.,,,,,,.

Метаанализ рандомизированных исследований интерферона в лечении вирусного гепатита С: влияние дозы и продолжительности

,

Hepatology

,

1996

, vol.

24

(стр.

778

—

89

) 8.,,, Et al.

Лечение хронического гепатита С консенсусным интерфероном: многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование

,

Hepatology

,

1997

, vol.

26

(стр.

747

—

54

) 9.,,, Et al.

Вирусная динамика гепатита С in vivo и противовирусная эффективность терапии интерфероном-а

,

Science

,

1998

, vol.

282

(стр.

103

—

7

) 10.,,,,,.

Динамика вируса гепатита С in vivo: влияние рибавирина и интерферона альфа на вирусный оборот

,

Hepatology

,

1998

, vol.

28

(стр.

245

—

52

) 11.,,,.

Гепатит С: вирусная кинетика

,

Гепатология

,

1997

, т.

26

(стр.

1691

—

93

) 12.,,, Et al.

Нуклеотидная последовательность геномной РНК вируса гепатита С, выделенная от человека-носителя: сравнение с описанными изолятами для консервативных и дивергентных областей

,

J Gen Virol

,

1991

, vol.

72

(стр.

2697

—

704

) 13.,,, Et al.

Предлагаемая система номенклатуры генотипов вируса гепатита С

,

Hepatology

,

1994

, vol.

19

(стр.

1321

—

4

) 14.,,, Et al.

Разработка и применение числовой системы баллов для оценки гистологической активности бессимптомного хронического активного гепатита

,

Hepatology

,

1981

, vol.

1

(стр.

431

—

5

) 15 ..

Конечно-разностный алгоритм для аппроксимации кривой

,

J Soc Ind Appl Math

,

1963

, vol.

11

(стр.

431

—

41

) 16.,. ,

Нелинейные модели для данных повторных измерений

,

1995

Лондон

Чепмен и Холл

17.

MathSoft. S-PLUS 4: руководство по статистике

,

1997

Сиэтл

Отдел продуктов анализа данных, MathSoft

18., , , и другие.

Интерферон альфа-2b отдельно или в комбинации с рибавирином для лечения рецидива хронического гепатита C

,

N Engl J Med

,

1998

, vol.

339

(стр.

1493

—

99

) 19.,,,,.

Прогнозирование ответа на терапию интерфероном альфа 2b у пациентов с хроническим гепатитом С с использованием вирусных и биохимических характеристик: сравнение

,

Hepatology

,

1997

, vol.

26

(стр.

1640

—

5

) 20.,,, И др.

Расовые различия в ответах на терапию интерфероном при хроническом гепатите C

,

Hepatology

,

1999

, vol.

30

(стр.

787

—

93

) 21.,,, Et al.

Сравнение полноразмерных последовательностей интерферон-чувствительного и устойчивого вируса гепатита С 1b: чувствительность к интерферону обеспечивается аминокислотными заменами в гене NS5A

,

J Clin Invest

,

1995

, vol.

96

(стр.

224

—

30

) 22.,,, Et al.

Мутации в неструктурном белке 5A и ответ на интерферон у пациентов с хронической инфекцией вируса гепатита C lb

,

N Engl J Med

,

1996

, vol.

334

(стр.

77

—

81

) 23.,,, Et al.

Доказательства того, что устойчивость вируса гепатита С к интерферону опосредована репрессией протеинкиназы PKR неструктурным белком 5a

,

Virology

,

1997

, vol.

230

(стр.

217

—

27

) 24.,,,,,.

Мутации в гене неструктурного белка 5A и ответ на интерферон при инфицировании вирусом гепатита С генотипа 2

,

Hepatology

,

1999

, vol.

30

(стр.

1045

—

53

) 25.,,, Et al.

Белок неструктурной области 5А вируса гепатита С является мощным активатором транскрипции

,

J Virol

,

1997

, vol.

71

(стр.

8856

—

59

) 26.,,,.

Мутации в области, определяющей чувствительность к интерферону вируса гепатита С, и транскрипционная активность белка NS5A

,

Hepatology

,

1998

, vol.

28

(стр.

1147

—

53

) 27.,,.

Мутации в неструктурном гене 5a изолятов европейского вируса гепатита С и ответ на интерферон альфа

,

Hepatology

,

1997

, vol.

25

(стр.

740

—

44

) 28.,,,,,.

Интерферонорезистентность вируса гепатита С генотипа lb: связь с неструктурными мутациями квазивидов 5A

,

J Virol

,

1998

, vol.

72

(стр.

2795

—

805

) 29.,,, Et al.

Мутации аминокислотной последовательности NS5A 2209–2248 вируса гепатита С 1b не предсказывают ответ на терапию рекомбинантным интерфероном-альфа у французских пациентов

,

J Hepatol

,

1997

, vol.

27

(стр.

72

—

77

) 30.,,,,.

Ингибирование интерферон-индуцируемой протеинкиназы PKR белком E2 HCV

,

Science

,

1999

, vol.

285

(стр.

107

—

10

) 31.,,, Et al.

Гуморальный иммунный ответ на гипервариабельный участок вируса гепатита С различается для генотипов lb и 2a

,

J Infect Dis

,

1997

, vol.

175

(стр.

505

—

10

) 32., , , и другие.

Широкореактивные антитела к гипервариабельной области 1 в сыворотках пациентов, инфицированных вирусом гепатита С: взаимосвязь с вирусной нагрузкой и ответ на интерферон

,

Hepatology

,

1998

, vol.

27

(стр.

1703

—

10

) 33.,,, Et al.

Ответы антител на гипервариабельную область 1 вируса гепатита С: данные о перекрестной реактивности и иммуноопосредованной вариации последовательности

,

Hepatology

,

1999

, vol.

30

(стр.

537

—

45

) 34.,,, Et al.

Динамика вариабельности гипервариабельной области 1 при инфицировании вирусом гепатита С и корреляция с клинико-вирусологическими особенностями заболевания печени

,

Hepatology

,

1998

, vol.

27

(стр.

1678

—

86

) 35.,,, Et al.

Влияние лечения интерфероном на противовирусный Т-клеточный ответ у пациентов, инфицированных вирусом гепатита С генотипа 1b и генотипа 2с

,

Hepatology

,

1997

, vol.

26

(стр.

792

—

7

) 36.,,.

Анализ концентрации РНК ВГС с помощью многоциклового ОТ-ПЦР у 3538 нелеченных пациентов с хроническим ВГС: оценка титра РНК по генотипу ВГС [аннотация]

,

Hepatology

,

1997

, vol.

26

pt 2

Suppl 4

pg.

186

37.,,, et al.

Обнаружение геномной и минус-цепи РНК ВГС в печени пациентов с хроническим ВГС с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР для цепей

,

Hepatology

,

1999

, vol.

29

(стр.

536

—

42

) 38.

Международная консенсусная конференция EASL по гепатиту C

Консенсусное заявление: Европейская ассоциация по изучению печени

,

J Hepatol

,

1999

, vol.

30

(стр.

956

—

61

) 39.,,,,.

Раннее прогнозирование и механизм эффекта двойной терапии рибавирином / IFN на хроническую инфекцию HCV [аннотация]

,

Hepatology

,

1999

, vol.

30

pt 2

Suppl 4

pg.

309

© 2000 Американского общества инфекционистов

Успешное лечение хронической инфекции вируса гепатита С генотипа 1b у пациента с компенсированным циррозом печени после трансплантации почки с использованием комбинированной терапии даклатасвиром и асунапревиром: отчет о клиническом случае и обзор литературы | Заместительная почечная терапия

Около 170–180 миллионов человек во всем мире хронически инфицированы ВГС [6].Распространенность инфекции у реципиентов трансплантата почки значительно выше, чем в общей популяции [7], и связана с повышенной заболеваемостью и смертностью [8]. У реципиентов ЛТ уровень инфицирования ВГС составляет 5–15% в развитых странах, при значительно более высоких показателях в развивающихся странах. После ЛТ у реципиентов, положительных по РНК HCV, повышается риск цирроза, гепатоцеллюлярной карциномы и смерти. Инфекция HCV также является независимым фактором риска потери трансплантата и связана с протеинурией, хроническим отторжением, гломерулопатией трансплантата, посттрансплантационным диабетом и гломерулонефритом, ассоциированным с HCV.Таким образом, профилактика и лечение инфекции ВГС является критическим фактором терапии лучевой терапией [5].

HCV — это положительный вирус с одноцепочечной РНК, который подразделяется на семь генотипов [9]. Генотип 1 является наиболее распространенным во всем мире, на его долю приходится примерно 60% инфекций [10]. Инфекция типа lb более тесно связана с развитием цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы, чем инфекция типа 2a или 2b, из-за ее роли в прогрессировании хронического воспаления печени до стадии цирроза [11].Противовирусная терапия на основе ИФН является стандартным подходом к борьбе с инфекцией ВГС. Однако KDIGO рекомендует рассматривать кандидатов на трансплантацию почки, инфицированных ВГС, для лечения стандартным ИФН перед трансплантацией, поскольку ИФН связан с более высокой частотой отторжения почечного аллотрансплантата [4]. В 2014 году метаанализ, проведенный Wei et al. продемонстрировали, что терапия на основе ИФН инфекции ВГС после ЛТ имеет низкую эффективность и ограниченную безопасность. Они нашли 12 клинических испытаний (всего 140 пациентов).Суммарные оценки частоты УВО, частоты отсева и отторжения трансплантата составили 26,6, 21,1 и 4% соответственно. Наиболее частым побочным эффектом, требующим прекращения лечения, была дисфункция трансплантата (45,1%) [12]. Как описано выше, при лечении пациентов с хроническим гепатитом С после ЛТ следует избегать использования терапии на основе ИФН, но без ИФН можно надеяться как на новое лечение для реципиентов ЛТ. ПППД демонстрируют потенциал большей эффективности в искоренении ВГС, а их пониженная токсичность делает их привлекательным вариантом лечения после ЛТ [5].Однако сообщений о терапии ПППД у реципиентов ЛТ очень мало. Все существующие отчеты касались противовирусной терапии на основе софосбувира (таблица 1) [13–15]. Kamar et al. [13] сообщили об эффективности и безопасности противовирусной терапии на основе софосбувира для лечения инфекции HCV после лучевой терапии. Они вылечили 25 реципиентов ЛТ с хронической инфекцией ВГС. Через 4 и 12 недель после завершения терапии ПППД у всех был достигнут УВО. Переносимость терапии против ВГС была отличной, побочных эффектов не наблюдалось. Sawinski et al.[14] показали 20 последовательных реципиентов ЛТ, получавших схемы противовирусного лечения на основе софосбувира без IFN. Все пациенты избавились от вируса во время терапии, и 100% достигли УВО через 12 недель после завершения терапии. Эти ПППД хорошо переносились, и менее чем половине пациентов потребовалась корректировка дозы ингибитора кальциневрина во время лечения. Hussein et al. [15] также продемонстрировали успешное лечение 4-го генотипа ВГС у реципиентов ЛТ софосбувиром и рибавирином. Они пролечили трех пациентов и достигли УВО12 без серьезных побочных эффектов.Софосбувир в основном выводится почками; поэтому его использование противопоказано пациентам с тяжелой почечной недостаточностью (скорость клубочковой фильтрации <30 мл / мин / 1,73 м ² ) или хронической почечной недостаточностью, находящихся на диализе [16].

Таблица 1 ПППД после трансплантации почки

Даклатасвир плюс асунапревир получил свое первое глобальное одобрение по этому показанию в Японии, что является первым полностью пероральным режимом без IFN- и рибавирина для HCV генотипа 1b [17].Кумада Х. и др. продемонстрировали, что 24-недельное лечение даклатасвиром и асунапревиром обеспечивает высокоэффективный вариант для пациентов, не перенесших трансплантацию, у которых в настоящее время нет эффективных вариантов лечения (не подходят или не переносят терапию на основе интерферона), а также для тех пациентов, которые не достигли УВО при предыдущем лечении . Кроме того, они описали, что 22 пациента с вирусологической неудачей имели полиморфизм NS5A L31 и / или Y93 до лечения. В данном случае вариантов в области L31M и Y93H не было.У пациентов было осложнение в виде компенсированного цирроза печени, и Kumada H. et al. также сообщили, что их пациенты с циррозом печени также достигли высоких показателей УВО ₂₄ (20/22, 90,9%) [18]. У большинства реципиентов ЛТ наблюдалась 3 и более стадия хронической болезни почек [19]. Следовательно, очень важно распознавать метаболизм DAA и лекарственные взаимодействия, и мы показали здесь эффективность DAA и использование корректировки дозы при почечной или печеночной недостаточности (Таблица 2) [20]. Даклатасвир и асунапревир в первую очередь метаболизируются в печени.Таким образом, предполагается, что нет необходимости корректировать дозы этих препаратов в зависимости от функции почек. Даклатасвир и асунапревир являются подходящими препаратами для реципиентов почечного трансплантата с нарушенной реальной функцией. Асунапревир является субстратом CYP3A, P-gp и OATP 1B1 и 2B1. Он ингибирует OATP 1B1, 1B3 и 2B1, а также P-gp и CYP2D6 и индуцирует CYP3A4. Даклатасвир и асунапревир противопоказаны пациентам, принимающим сильные индукторы CYP3A4, такие как рифампицин, рифабутин, фенитоин, карбамазепин, фенобарбитал, системный дексаметазон, а также продукты, содержащие продукты, содержащие Hypericum perforatum (St.Зверобой) [21]. Асунапревир также противопоказан пациентам, принимающим циклоспорин [22].

Таблица 2 Характеристики ПППД и корректировки дозы при почечной или печеночной недостаточности

У нашего пациента была умеренная почечная и печеночная недостаточность (степень А по шкале Чайлд-Пью), и лечение даклатасвиром в сочетании с асунапревиром было высокоэффективным в устранении ВГС без каких-либо побочных реакций, кроме небольшого повышения сывороточного креатинина и минимального уровня такролимуса.

Чувствительность вариантов вируса гепатита C генотипа 1a, 1b и 3 к ингибитору NS5A Эльбасвир

РЕЗЮМЕ

Эльбасвир — экспериментальный ингибитор NS5A с активностью in vitro и против нескольких генотипов HCV. Противовирусную активность эльбасвира измеряли в репликонах, полученных из дикого типа или устойчивых вариантов генотипов 1a, 1b и 3. Барьер устойчивости оценивали по количеству устойчивых колоний, отобранных при воздействии различных концентраций элбасвира.В исследовании фазы 1b с увеличением дозы вирусологический ответ был определен у 48 нецирротических взрослых мужчин с хронической инфекцией генотипа 1 или 3, рандомизированных на плацебо или элбасвир в дозе от 5 до 50 мг (генотип 1) или от 10 до 100 мг (генотип 3) один раз в сутки. на 5 дней. Ген NS5A был секвенирован из образцов плазмы, полученных до, во время и после лечения. Эльбасвир подавлял появление резистентно-ассоциированных вариантов (RAV) in vitro в зависимости от дозы. Варианты, выбранные путем воздействия высоких концентраций элбасвира, обычно кодируют множественные аминокислотные замены (чаще всего с локусами 30, 31 и 93), что обеспечивает высокий уровень устойчивости к элбасвиру.В исследовании монотерапии пациенты с генотипом 1b имели большее снижение уровней РНК HCV, чем пациенты с генотипом 1a при всех дозах элбасвира; ответы у пациентов с генотипом 3, как правило, были менее выраженными, чем у пациентов с генотипом 1, особенно при более низких дозах элбасвира. M28T, Q30R, L31V и Y93H в генотипе 1a, L31V и Y93H в генотипе 1b и A30K, L31F и Y93H в генотипе 3 были преобладающими RAV, выбранными при монотерапии элбасвиром. Вирусологические данные пациентов соответствовали доклиническим наблюдениям.NS5A-RAV чаще всего появлялись в положениях аминокислот 28, 30, 31 и 93 как в лабораторных, так и в клинических испытаниях. (Испытание MK-8742 P002 было зарегистрировано на ClinicalTrials.gov под идентификатором NCT01532973.)

ВВЕДЕНИЕ

Эльбасвир (MK-8742) — низкомолекулярный ингибитор неструктурного белка 5A (NS5A) вируса гепатита C (HCV). разрабатывается как компонент схем лечения хронической инфекции ВГС (1–4). Эльбасвир обладает активностью против генотипов 1a, 1b и 3 in vitro , в том числе против некоторых вирусных вариантов, устойчивых к другим ингибиторам NS5A (4).В исследовании фазы 1b повышения дозы элбасвир один раз в день в течение 5 дней приводил к среднему снижению уровней РНК ВГС с 3,7 до 5,1 log ₁₀ МЕ / мл у пациентов с инфекциями генотипа 1a или 1b, получавших от 5 до 50 мг / день и ∼3 log ₁₀ МЕ / мл у пациентов с генотипом 3, получавших 50 или 100 мг / день (3). В более поздних испытаниях фазы 2 лечение элбасвиром в сочетании с гразопревиром (MK-5172, исследуемый ингибитор протеазы NS3 / 4A для приема один раз в сутки) с рибавирином или без него в течение 12 недель приводило к устойчивому вирусологическому ответу на 12 неделе (УВО ₁₂ ) от 87 до 98% для пациентов с инфекциями генотипа 1, в том числе в подгруппах, которые исторически трудно поддаются лечению (1, 2).

Устойчивость к лекарствам представляет собой проблему для схем с сохранением интерферона при хронической инфекции ВГС (5–12). Варианты, связанные со снижением лекарственной чувствительности, существуют на низких уровнях у большинства пациентов до любого воздействия противовирусных агентов прямого действия. Предсуществующие варианты, связанные с устойчивостью (RAV), могут затем стать доминирующим видом под действием селективного лекарственного средства во время или после противовирусной терапии прямого действия. В текущем отчете сравниваются и противопоставляются RAV, выявленные в доклинических исследованиях, с исходными и новыми вариантами, обнаруженными в ходе исследования фазы 1b с увеличением дозы с использованием монотерапии элбасвиром в течение 5 дней у пациентов, хронически инфицированных генотипами 1 и 3 HCV (3).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Доклинические исследования. Репликоны HCV были использованы для определения эффективных концентраций (EC) элбасвира, необходимых для подавления уровней РНК HCV на определенный процент (50% или 90%) для генотипов 1a, 1b и 3 вариантов по сравнению с отсутствием лечения (13). Репликоны, содержащиеся в 0,5 мг / мл G418 (HyClone, GE Healthcare Bio-Sciences, Питтсбург, Пенсильвания, США), для отбора реплицирующихся клеток высевали на 384-луночные планшеты в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 5% фетальной сыворотки теленка.На следующий день к среде добавляли двукратные разведения элбасвира с концентрацией от 1 мкМ до 0,002 мкМ в присутствии 0,5% диметилсульфоксида (ДМСО). После 72 ч инкубации клетки собирали и подвергали ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени (ОТ-ПЦР) (14). Для каждого варианта количество пороговых циклов наносили на график против журнала концентраций элбасвира и подгоняли к сигмовидной кривой зависимости реакции от дозы с помощью Prism (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США), чтобы получить ЕС ₅₀ и ЕС ₉₀ ( концентрации лекарственного средства, необходимые для достижения 50% и 90% ингибирования, соответственно, по сравнению с контролем ДМСО без лекарственного средства).Для справки: минимальная стационарная концентрация ( C _мин ) для ежедневного приема 50 мг элбасвира составляет около 22 нМ (3).

Для отбора клеточных линий со сниженной чувствительностью к элбасвиру субконфлюэнтные монослои репликонных клеток культивировали в присутствии различных концентраций лекарственного средства, кратных ЕС ₉₀ . Планшеты готовили из расчета 2 × 10 ⁵ клеток на 60-мм планшет и пассировали только один раз в соотношении 1:10, когда клетки достигли 95% слияния.Выжившие отобранные колонии сначала подсчитывали, а затем объединяли и расширяли для анализа. Количество колоний в присутствии элбасвира делили на количество засеянных клеток, чтобы рассчитать частоту резистентности. Общую клеточную РНК выделяли из объединенных колоний и амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР. Продукты RT-PCR очищали с помощью набора для очистки QIAquick PCR (Qiagen, Germantown, MD, USA) и секвенировали полноразмерный ген NS5A. Кроме того, продукты RT-PCR были клонированы в вектор TOPO TA (Invitrogen), и плазмидная ДНК из бактериальных колоний была секвенирована для поиска связанных вариаций.Репликативная способность («приспособленность») RAV оценивалась в анализе образования репликонов колоний (13).

Дизайн рандомизированного клинического исследования фазы 1b. MK-8742 P002 представлял собой рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование с последовательным увеличением дозы монотерапии элбасвиром для оценки безопасности, фармакокинетики и вирусного ответа у взрослых мужчин с хроническим ВГС. -1 или HCV-3 (3). Подходили пациенты в возрасте от 18 до 60 лет (до 65 лет по усмотрению исследователя) с уровнем РНК HCV> 100 000 МЕ / мл.Дозы эльбасвира составляли 5, 10 и 50 мг один раз в день для пациентов, инфицированных генотипом 1a или 1b, и 10, 50 и 100 мг один раз в день для пациентов, инфицированных генотипом 3. В общей сложности 6 пациентов должны были быть включены в каждую дозировку. уровень, в том числе 5 пациентов, получавших элбасвир, и 1 пациент, получавший соответствующее плацебо перорально в течение 5 дней подряд, начиная с самой низкой дозы для инфекционного генотипа. Дозы увеличивали поэтапно после того, как были проанализированы адекватные данные о безопасности для предыдущей группы дозирования.Тестирование вирусной нагрузки и устойчивости должно было выполняться ежедневно и через день, соответственно, в течение первых 10 дней исследования, а затем через 2 недели, 3 недели, 1 месяц и 2 месяца после последней дозы элбасвира. Исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами надлежащей клинической практики. Все участники предоставили письменное информированное согласие.

Количественный анализ вирусов, секвенирование и анализ устойчивости. В исследовании фазы 1b (3) уровни РНК ВГС измерялись в образцах плазмы, полученных на исходном уровне, во время и в конце монотерапии элбасвиром, а также при периодических контрольных визитах TaqMan 2.0 (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ, USA) с нижними пределами количественного определения и обнаружения 25 и 9,3 МЕ / мл соответственно. Образцы крови были также собраны для тестирования на вирусную резистентность в заранее определенные моменты времени, в том числе до первой дозы элбасвира, около нижнего предела уровня РНК ВГС и до 2 месяцев после последней дозы элбасвира при условии, что уровень РНК ВГС оставался> 1000. МЕ / мл.

Полноразмерный ген NS5A амплифицировали из образцов плазмы с помощью ОТ-ПЦР с последующим популяционным и селективным клональным секвенированием (15).Из-за чувствительности анализа анализы устойчивости обычно выполнялись только на образцах с уровнем РНК HCV> 1000 МЕ / мл. Полученные аминокислотные последовательности сравнивали с референтами генотипа 1a (H77; GenBank № NC_004102), генотипа 1b (con1; GenBank № AJ238799) или генотипа 3 (S52; GenBank № GU814263). Предполагалось, что предел обнаружения вариантов при популяционном секвенировании составляет от ~ 20 до 25% квазивидов вируса (16). Полиморфизмы, выявленные у ≥10% пациентов, были выбраны для более детального анализа.Для клонального секвенирования аминокислоты с 1 по 448 NS5A амплифицировали с помощью RT-PCR, и полученные ампликоны клонировали в вектор TOPO TA (Invitrogen). В каждый момент времени секвенировали примерно 40 клонов. В анализ были включены полиморфизмы, обнаруженные более чем в одном клоне.

В фенотипических анализах для определения противовирусной активности элбасвира против обнаруженных вариантов были сконструированы генотип-специфические репликоны, включающие полиморфизмы NS5A. Сдвиг ( n раз) в EC элбасвира для каждого варианта репликона был выражен относительно EC для соответствующего репликона дикого типа.Пригодность устойчивых вариантов оценивали путем сравнения количества колоний с референтом дикого типа.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Доклинические результаты. (i) Активность элбасвира против репликонов генотипа 1a и 1b. В 3-дневном анализе репликонов EC ₉₀ элбасвира составляло 0,006 нМ для репликонов 1a_H77 и 1b_con1 дикого типа (таблица 1). EC ₉₀ элбасвира против генотипа 1a сдвигается в 13 раз до 0,08 нМ, когда 40% сыворотки человека добавляется к среде для анализа в дополнение к стандартной 5% сыворотке плода теленка.Для оценки активности элбасвира против ряда генетически разнообразных клинических изолятов более 200 независимых последовательностей генотипа 1, собранных из клинических баз данных, были подвергнуты филогенетическому анализу. Полноразмерные последовательности NS5A от 5 пациентов с генотипом 1a и 4 пациентов с генотипом 1b затем синтезировали и клонировали в субгеномный репликон con1. ЕС ₉₀ эльбасвира варьировался от 0,01 до 0,02 нМ для генотипа 1a и от 0,01 до 0,03 нМ для генотипа 1b.

ТАБЛИЦА 1

Активность элбасвира против репликонов вариантов NS5A генотипа 1 HCV ^a

(ii) Активность элбасвира против репликонов генотипа 3.Чтобы оценить эффективность элбасвира против генотипа 3, субгеномный репликон, несущий последовательность NS5A генотипа 3, сначала был сконструирован путем клонирования полноразмерного гена NS5A из изолята пациента (номер доступа в GenBank NC_009824) в фон репликона con1, давая клетку линия с эльбасвиром EC ₉₀ 0,12 нМ (Таблица 2). Впоследствии более 100 независимых последовательностей генотипа 3, собранных из клинических баз данных, были подвергнуты филогенетическому анализу, из которого были отобраны 11 уникальных и некластеризованных последовательностей для обеспечения генетического разнообразия и клонированы в репликоны con1 и JFH для дальнейшей оценки.Во всех случаях репликоны, содержащие основную цепь JFH, давали более высокое количество колоний, чем конструкции con1. В то время как остовы репликона con1 и JFH по-разному влияли на приспособленность к репликации, эффективность элбасвира оставалась почти постоянной независимо от остова репликона. Эльбасвир ЕС ₉₀ оставался в субнаномолярном диапазоне для всех протестированных вариантов.

ТАБЛИЦА 2

Активность элбасвира против репликонов 3-го генотипа HCV ^a

(iii) Селекция по устойчивости репликонов генотипа 1 и генотипа 3.Чтобы исследовать резистентный барьер для элбасвира, репликоны генотипов 1a, 1b и 3 обрабатывали элбасвиром в присутствии G418. Выжившие колонии подсчитывали, и объединенные колонии подвергали фенотипическому и генотипическому анализу (таблица 3). Эльбасвир продемонстрировал дозозависимое подавление репликонов резистентного генотипа 1a, о чем свидетельствует уменьшение количества колоний при более высоких дозах. Число выживших колоний составляло 204, 56 и 4, соответственно, в присутствии 0,06 нМ, 0,6 нМ и 6 нМ элбасвира (от 10 × до 1000 × EC ₉₀ против репликона контрольного генотипа 1a).Клетки появлялись как слабо связанные между собой колонии при 1 × EC ₉₀ , которых было слишком много для подсчета. Репликоны, отобранные обработкой высокими дозами элбасвира, обладали высокой устойчивостью к элбасвиру, что было измерено по сдвигу кратности в EC ₉₀ от значений, определенных в клетках, обработанных ДМСО в отсутствие лекарственного средства. Частота резистентности составила 0,002% при 6 нМ элбасвире. Популяционное секвенирование полной длины гена NS5A идентифицировало Y93N как единственную замену, выбранную путем воздействия 0.6 нМ элбасвира. После воздействия 6 нМ элбасвира Q30D был обнаружен во всех колониях, обычно связанных с Y93N. Клональный анализ подтвердил связь Q30D-Y93N в клетках, обработанных 6 нМ эльбасвиром. Y93N придает высокий уровень устойчивости к эльбасвиру in vitro .

ТАБЛИЦА 3

Отбор in vitro RAV в репликонах генотипа 1a, 1b и 3a после воздействия различных концентраций элбасвира ^a

Для репликонов генотипа 1b также наблюдали дозозависимое подавление устойчивости.Соответствующее количество отобранных выживших колоний составляло 122, 38, 5 и 3 в присутствии 0,006 нМ, 0,06 нМ, 0,6 нМ и 6 нМ элбасвира (в диапазоне от 1 × до 1000 × EC ₉₀ для контрольного генотипа 1b. репликон). По сравнению с генотипом 1a, меньше колоний появилось в генотипе 1b при 1 ×, 10 × и 100 × EC ₉₀ в идентичных экспериментальных условиях. Y93H был основной вариацией в популяции, получавшей 0,006 нМ эльбасвира. Y93H и V121I были обнаружены в клетках, обработанных 0.06 нМ элбасвира и связывание Y93H-V121I подтверждали клональным анализом. Клетки, подвергнутые воздействию 0,6 нМ элбасвира, не смогли разрастаться и, следовательно, были недоступны для тестирования. L31F, Y93H и V121I были обнаружены в клетках, обработанных 6 нМ элбасвиром, а связь L31F-Y93H-V121I была идентифицирована в 80% протестированных клонов. Y93H был связан с высоким уровнем устойчивости к эльбасвиру.

Субгеномная линия клеток репликона, несущая последовательность NS5A генотипа 3 из изолята пациента (NC_009824), клонированная в фон con1 с elbasvir EC ₉₀ 0.12 нМ использовали для экспериментов по селекции устойчивости к генотипу 3. Что касается генотипа 1a и генотипа 1b, репликоны генотипа 3 обрабатывали элбасвиром в количестве, кратном EC ₉₀ . Бесчисленные колонии росли в присутствии 0,12 нМ и 1,2 нМ элбасвира (что соответствует 1 × и 10 × EC ₉₀ ). Популяционное секвенирование выявило низкие уровни вариантов Y93H и E92K. Увеличение концентраций элбасвира до 12 нМ и 120 нМ (что соответствует 100 × и 1000 × EC ₉₀ ) значительно снизило количество устойчивых колоний до 23 и 15 соответственно.Анализ 40 индивидуальных клонов не выявил связи между вариациями Y93H и E92K. Y93H придает устойчивость к эльбасвиру высокого уровня. Установление репликона генотипа 3 с использованием одного только E92K не увенчалось успехом, несмотря на многочисленные попытки, что позволяет предположить, что выделенная замена E92K сделала вариант непригодным.

(iv) Активность элбасвира против вариантов, выбранных другими ингибиторами NS5A. RAV NS5A, ранее идентифицированные в клинических испытаниях с другими ингибиторами NS5A, были включены в число устойчивых вариантов, выбранных в наших экспериментах.Замены возникали в основном на аминокислотных остатках 28 (генотип 1a и 1b), 30 (генотип 1a), 31 (генотипы 1a и 1b) и 93 (генотипы 1a, 1b и 3) (17). В репликонах, содержащих индивидуальные замены NS5A, EC ₉₀ элбасвира против 9 из 13 протестированных вариантов генотипа 1a имели увеличение EC ₉₀ более чем в 10 раз (диапазон от 12 до 1333 раз), тогда как ЕС ₉₀ с только 2 из 6 протестированных вариантов генотипа 1b увеличились более чем в 10 раз по сравнению с диким типом [L31F (44 ×) и Y93H (67 ×)] (Таблица 4).Все 3 протестированных варианта генотипа 3a имели увеличение ЕС ₉₀ более чем в 20 раз.

ТАБЛИЦА 4

Эффективные ингибирующие концентрации элбасвира против вариантных репликонов ^a

(v) Пригодность RAV в анализе репликона. Пригодность устойчивых вариантов оценивалась в анализе образования репликона, в котором репликон РНК из резистентной вариации трансфицировали в клетки Huh7, отбирали и подсчитывали колонии репликонов. В этом анализе замены в положениях 30 и 31 аминокислот в репликонах генотипа 1a хорошо переносились (репликативная способность варьировалась от 41% до 100% от репликативной способности дикого типа), тогда как вариации в положении 93 снижали приспособленность репликона на ≥85% ( Таблица 5).В частности, Y93H резко снижает репликацию до <1% по сравнению с репликацией репликона генотипа 1a дикого типа. Репликация генотипа 1b была чувствительна к изменениям в аминокислотах 31 и 93. L31V / F и Y93H / C вызывали резкое снижение приспособленности генотипа 1b, уменьшая количество колоний до <2% от числа колоний дикого типа. Напротив, Y93H / C в репликонах генотипа 3 умеренно снижает репликативную способность до 50% от репликативной способности дикого типа.

ТАБЛИЦА 5

Репликативная способность (приспособленность) вариантов в репликонах генотипа 1a_H77 или генотипа 1b_con1

Результаты клинических испытаний фазы 1b.(i) Учет субъектов. В общей сложности 48 пациентов получали элбасвир или плацебо в исследовании с определением дозировки элбасвира (3), в том числе 17 пациентов с генотипом 1a, 13 пациентов с генотипом 1b и 18 пациентов с генотипом 3. Все пациенты завершили 5 дневной курс терапии. Ошибочная маркировка 7 образцов от 3 пациентов (по 1 инфицированному генотипом 1a, 1b или 3) произошла в центре секвенирования; поэтому эти образцы были исключены из анализа. Исходный вирус от 1 дополнительного пациента с генотипом 3 не может быть амплифицирован.Следовательно, для анализа устойчивости использовались только данные о последовательности от других 44 пациентов (включая 16 с генотипом 1a, 12 с генотипом 1b и 16 с генотипом 3).

Варианты с заменами NS5A в положениях 28, 30, 58 и 93 (которые ранее были определены как потенциальные RAV для ингибиторов NS5A) были обнаружены на исходном уровне у 7 из 44 пациентов (15,9%) (таблица 6). За исключением, возможно, 1 пациента, инфицированного генотипом 3 в группе с дозой 10 мг элбасвира, исходные варианты NS5A, по-видимому, не влияли на величину снижения вирусной нагрузки во время лечения.В частности, M28V или Q30R в генотипе 1a и Y93H в генотипе 1b на исходном уровне мало влияли на величину снижения вирусной нагрузки во время лечения.

ТАБЛИЦА 6

Пациенты с исходными вариантами NS5A в положениях 28, 30, 58 и 93, обнаруженными популяционным секвенированием в испытании фазы 1b ^a

Постбазовое секвенирование было выполнено для 35/36 реципиентов элбасвира (97,2%) во время контрольных посещений. Единственным исключением был пациент с генотипом 1b, у которого уровни РНК ВГС были <1000 МЕ / мл на всех контрольных визитах.Эти постбазовые последовательности сравнивали с результатами до лечения, чтобы идентифицировать варианты, требующие лечения, отобранные с помощью элбасвира. Наиболее распространенные варианты postbaseline (присутствующие у> 10% пациентов) кодировали M28T, Q30R, L31V или Y93H в генотипе 1a, L31V или Y93H в генотипе 1b и A30K, L31F и Y93H в генотипе 3 (рис. 1). Из замен в 4 положениях аминокислот, указанных на графике, наиболее распространенными были Y93H / C / N и L31V / M / I / F, встречающиеся в 83% (29/35) и 54% (19/35) постбазовые последовательности, полученные от 35 пациентов.Постбазовые вариации в положении 30 наблюдались у 37% (12/35) пациентов, включая 11 последовательностей генотипа 1a с Q30R и 1 последовательность генотипа 3a с A / E / K / T30K. M28T, L28M или V28A были отмечены у 20% (7/35) пациентов.

Рис. 1.

Распространенность специфических аминокислотных замен в установленных локусах устойчивости к NS5A, обнаруженная путем популяционного секвенирования после монотерапии элбасвиром в исследовании фазы 1b. Столбчатый график отображает наиболее распространенные варианты после базового уровня, выявленные у пациентов, инфицированных генотипом (GT) 1a, 1b или 3 в исследовании фазы 1b.Среди исследованных полиморфизмов замены в аминокислотах 28, 30, 31 и 93 наблюдались каждый более чем у 10% оцениваемых пациентов.

Для пациентов с генотипом 1a, 10/11 и 8/11, соответственно, с вариантами в положениях 30 и 31 все еще имели изменения в этих локусах при последнем наблюдении. Для пациентов с генотипом 1b 8/9 с вариантами в положении 93 имели стойкие изменения в этом локусе при последнем наблюдении. Для пациентов с генотипом 3 11/11 с вариантами в положении 93 имели стойкие изменения в этом локусе при последнем наблюдении.

(ii) Инфекции генотипа 1. Все дозы элбасвира приводили к быстрому снижению РНК ВГС с 3,7 до 5,1 log ₁₀ МЕ / мл при инфекциях генотипа 1 (3). В той же дозе большее снижение вирусной нагрузки было достигнуто при инфекциях с генотипом 1b, чем при инфекциях с генотипом 1a. Снижение вирусной нагрузки после прекращения 5-дневной монотерапии элбасвиром было более устойчивым у пациентов с генотипом 1b, чем у пациентов с генотипом 1а при той же дозе элбасвира. В целом, типы и распространенность RAV после исходного уровня, выбранных в рамках каждого субгенотипа, были сходными для разных уровней дозирования.

У 2 пациентов с генотипом 1a с предварительным лечением полиморфизмами M28V или Q30R снижение вирусной нагрузки> 3-log было достигнуто при дозировке 5 мг и 50 мг элбасвира соответственно. У пациента с исходным уровнем M28V (который не вызывал устойчивости к эльбасвиру in vitro ), получавшего 5 мг элбасвира, Q30H / Q и L31L / V были дополнительно обнаружены в течение периода последующего наблюдения после лечения вместе с M128V / A. . Клональный анализ выявил связи между M28V и L31V, а также между M28A и Q30H, но не было обнаружено связи между L31V и Q30H.Только M28V был обнаружен при последнем наблюдении на 61-й день путем популяционного секвенирования. У пациента с генотипом 1a с исходным уровнем Q30R (связанного с 24-кратным увеличением EC ₉₀ in vitro элбасвира), получавшего 50 мг элбасвира, Q30R был обнаружен с L31V с конца лечения до последнего. наблюдение на 56-й день. Клональное секвенирование для этого пациента не проводилось. Один пациент с генотипом 1b со смесями Y93H / Y и A92T / A на исходном уровне, получавший 50 мг элбасвира, достиг снижения вирусной нагрузки> 4 log (хотя Y93H был связан с 67-кратным увеличением элбасвира EC _90). in vitro ).После прекращения лечения клональное секвенирование выявило L28M, связанный с Y93H, и L31V, связанный с A92K, без связи между Y93H и L31V или A92K. При последнем посещении на 59-й день с помощью секвенирования популяции были обнаружены только смеси Y93H / Y и L31V / L.

(iii) Инфекции генотипа 3. Антивирусные ответы были менее устойчивыми для генотипа 3, чем для инфекций генотипа 1 в группе, принимавшей 10 мг элбасвира, но среднее снижение РНК ВГС примерно на 3 log было достигнуто при дозах 50 и 100 мг. дозы (3).Y93H после лечения был обнаружен у всех 10 пациентов в группах с дозировкой 50 и 100 мг элбасвира и сохранялся в течение последнего периода наблюдения в каждом случае. L31F также был обнаружен у 2 из этих пациентов.

Один из 3 обследованных пациентов с инфекцией генотипа 3 в группе дозы 10 мг имел исходную смесь A30A / E / K / T и имел снижение уровня РНК HCV <1-log ₁₀ МЕ / мл. в надире по сравнению со средним падением виремии на 1,43-log ₁₀ у двух других пациентов в группе, получавшей дозу 10 мг, без обнаруживаемых RAV на исходном уровне.Популяционное секвенирование показало, что A30A / E / K / T превращается в A30K (что дает 41-кратное увеличение ЕС эльбасвира ₉₀ in vitro ) от прекращения лечения до последнего наблюдения на 61-й день.

ОБСУЖДЕНИЕ

В доклинических экспериментах элбасвир проявил более сильную противовирусную активность против генотипов 1a и 1b (EC ₉₀ , 0,006 нМ), чем против репликонов генотипа 3 (EC ₉₀ , 0,12 нМ). В тестах отбора устойчивости de novo эльбасвир подавлял появление устойчивых колоний генотипа 1 и генотипа 3 дозозависимым образом.При одинаковом давлении отбора (выраженном как кратные EC ₉₀ элбасвира) устойчивые колонии возникали реже в генотипе 1b, чем в генотипе 1a, при 10x или 100x EC ₉₀ . При 1000 × EC ₉₀ частота устойчивых колоний была сходной в репликонах генотипа 1a и 1b; большинство этих RAV задействовано более чем в одном локусе устойчивости, что позволяет предположить, что доза элбасвира 1000 × EC ₉₀ может подавлять RAV, включая только одну замену аминокислоты.В генотипе 3 увеличение давления отбора с 10 × EC ₉₀ до 100 × EC ₉₀ значительно уменьшило количество устойчивых колоний, хотя дальнейшее увеличение до 1000 × EC ₉₀ не привело к постепенному снижению. Повышенные дозы отбирали клетки, которые были высокорезистентными и содержали одинарные и двойные аминокислотные замены. Хотя элбасвир сохранил значимую активность в отношении некоторых клинически значимых вариантов NS5A, чувствительность in vitro была значительно снижена по сравнению с вариантами генотипа 1a и 3, несущими определенные замены в определенных локусах, особенно в положении 93 (Y93N и Y93H, соответственно).Напротив, замены в генотипе 1b (включая Y93H) вызвали гораздо меньшую потерю активности. Контекст последовательности NS5A может влиять на уровень устойчивости сверх того, что можно отнести к отдельным RAV (17). Не следует ожидать перекрестной устойчивости к ингибиторам протеазы NS3 (18).

В последующем исследовании небольшого увеличения дозы элбасвира в виде 5-дневной монотерапии, снижение вирусной нагрузки было больше для инфекций генотипа 1, чем у генотипа 3, особенно при более низких дозах элбасвира (3).Снижение уровней РНК ВГС, как правило, было более выраженным и продолжительным при инфекциях, вызванных генотипом 1b, чем генотипом 1a. Устойчивые противовирусные ответы наблюдались в присутствии исходных вариантов M28V или Q30R при инфекции генотипа 1a или исходного варианта Y93H при инфекциях генотипа 1b. Вариации в локусах устойчивости, общие для других ингибиторов NS5A, возникли после монотерапии элбасвиром. Популяционное секвенирование выявляло RAV NS5A реже в генотипе 1b, чем в инфекциях генотипа 1a.Восстановление вируса после прекращения терапии обычно происходило медленнее при генотипе 1b, чем при генотипе 1а. При клональном секвенировании полиморфизмы могут быть обнаружены в значительной части вирусной популяции независимо от генотипа. Эволюция вариантов была динамичной, со временем менялась связь замен.

Противовирусная активность и профиль резистентности элбасвира, наблюдаемые у пациентов, в целом можно было предсказать на основании доклинических данных. Аналогичные РАВ были отобраны in vitro и in vivo .Популяционное секвенирование вирусов от пациентов, включенных в исследование фазы 1b, подтвердило, что M28T, Q30R, L31V и Y93H в генотипе 1a, L31V и Y93H в генотипе 1b и A30K, L31F и Y93H в генотипе 3 являются преобладающими RAV, выбранными при монотерапии элбасвиром. . Варианты, содержащие эти замены, имели пониженную чувствительность к элбасвиру в репликонах ВГС с переменной репликативной способностью. Фенотипическое влияние миноритарных вариантов в большинстве случаев еще не установлено.

Доклинические генотипические и фенотипические анализы предвосхитили клинические результаты исследования фазы 1b (3).Среди генотипа 1b было отобрано меньше устойчивых колоний среди генотипа 1b, чем у генотипа 1a или 3 квазивидов во всем диапазоне дозирования, испытанном в лаборатории. Эти наблюдения in vitro и соответствовали большему противовирусному эффекту, наблюдаемому у пациентов с инфекциями генотипа 1b по сравнению с инфекциями генотипа 1а или 3 во время клинического испытания. Напротив, in vitro репликативная способность («вирусная пригодность») не может надежно объяснить кинетику вирусной нагрузки in vivo .Варианты, которые нарушали приспособленность в анализе образования колоний (проиллюстрированные заменами Y93 в генотипе 1a), часто возвращались как основные виды, сохраняясь после прекращения монотерапии элбасвиром.

Интригующее наблюдение о том, что некоторые РАВ с нарушенной приспособленностью в анализе образования колоний снова стали основными видами у пациентов после прекращения монотерапии элбасвиром, может отражать анализ или биологические факторы. Поскольку измерения in vitro, и in vivo, имеют разные цели, в некоторых случаях можно ожидать несоответствия.В то время как анализ репликона дает количество клеток, которые поддерживают репликацию ВГС в лаборатории, измерения вирусной нагрузки дают фактическое количество циркулирующих вирусов у пациента. Влияние замены в NS5A может до некоторой степени зависеть от окружающего контекста, включая степень фосфорилирования (19). Адаптивные аминокислотные изменения в другом месте и / или вне NS5A в вирусе, не включенные в репликон, могут усиливать репликацию определенных RAVs in vivo .Большинство известных замен, связанных с лекарствами, локализованы в домене I, и гораздо меньше известно о влиянии вариантов в доменах II и III (20). Замены в доменах II и III обычно непосредственно не вызывают сдвиг в репликоне EC ₅₀ ; однако влияние этих замен на репликацию вируса в контексте полиморфизмов в домене I систематически не исследовалось.

Дифференциальное влияние RAV на исходы инфекций генотипа 1a и 1b в клинических испытаниях соответствовало более низкой степени устойчивости, наблюдаемой in vitro, с заменами в генотипе 1b по сравнению с репликонами генотипа 1a.В базовом исследовании C-EDGE пациентов, ранее не получавших лечение (21), УВО ₁₂ был достигнут у 2 из 9 (22%) оцениваемых пациентов, инфицированных генотипом 1a с исходными NS5A RAV, которые обеспечивали более чем 5-кратное снижение чувствительности к элбасвиру. , в отличие от 9 из 10 (90%) пациентов с исходным уровнем NS5A RAV, обеспечивающих ≤5-кратное снижение чувствительности, и 133 из 135 (99%) пациентов без исходного уровня NS5A RAV. Напротив, 16 из 17 (94%) подлежащих оценке пациентов с инфекциями генотипа 1b, несущими исходные NS5A RAV, дающие более чем 5-кратное снижение чувствительности, достигли УВО ₁₂ .

Результаты с другими ингибиторами NS5A предполагают обобщение этого наблюдения (22). Например, у пациентов с исходным уровнем NS5A RAV, получавших ингибитор NS5A даклатасвир в сочетании с асунапревиром (ингибитор протеазы NS3) и беклабувиром (ненуклеозидный ингибитор полимеразы NS5B), УВО ₁₂ был достигнут у 25 (74%) из 34 пациентов. с инфекцией генотипа 1a по сравнению со всеми 17 (100%) пациентами с инфекцией генотипа 1b (23). Не было очевидной связи между исходными вариантами NS3 или NS5B и УВО ₁₂ .Как было обнаружено в исследованиях C-EDGE (21, 24), результаты UNITY-1 снова указали на клинически значимое влияние исходных NS5A RAV на исход лечения с сохранением интерферона исключительно при генотипе 1a, в отличие от инфекций генотипа 1b.

Эльбасвир плюс гразопревир (исследуемый ингибитор протеазы NS3 / 4A) в виде пероральной однократной комбинированной таблетки с фиксированной дозой для приема внутрь в настоящее время разрабатывается для лечения хронической инфекции ВГС (1, 2, 21, 24–26). Дальнейший анализ исследований фазы 3 гразопревира-эльбасвира вскоре предоставит более важные данные, касающиеся безопасности и эффективности этой новой противовирусной комбинации двойного прямого действия.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Мы признательны всем пациентам, поставщикам медицинских услуг и исследователям, участвовавшим в исходном исследовании. Мы также благодарим Роберта Нахбара, Дональда Грэма, Дэвида Никля, Роберта Чейза, Николаса Морина и Эрнеста Асанте-Аппиа из Merck за их вклад в анализ. Мы также признательны Карин Дэвис из компании Merck за техническую помощь в подготовке рукописи.

Merck Sharp & Dohme Corp., дочерняя компания Merck & Co., Inc., разрабатывает элбасвир (MK-8742) в качестве компонента комбинированной терапии хронических инфекций ВГС. Компания спонсировала и профинансировала клиническое исследование и анализ производных, о которых сообщается здесь. Предпоследняя версия статьи была рассмотрена спонсором.

Как нынешние или бывшие сотрудники Merck, авторы могут владеть акциями и / или опционами на акции компании. Все авторы имели полный доступ к любым относящимся к делу данным по запросу. Каждый соавтор одобрил по существу окончательную версию рукописи.Мнения, выраженные в этом отчете, представляют собой консенсус авторов и не обязательно отражают официальную позицию Merck.

СНОСКИ

• Получено 23 июня 2015 г.
• Возвращено для модификации 28 июля 2015 г.
• Принято 18 августа 2015 г.
• Принято рукопись размещена в Интернете 24 августа 2015 г.

• Авторское право © 2015, American Society for Микробиология. Все права защищены.

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Т-клеточный иммунитет генотипа 3a HCV: специфичность, функция и влияние терапии

Значение исследования

Что уже известно об этой теме?

• Генотип-3a вируса гепатита C (HCV) в настоящее время является наиболее распространенным подтипом HCV в Великобритании и Южной Азии.

• Профилактические и терапевтические вакцины против инфекции генотипа 1 в настоящее время разрабатываются. Однако Т-клетки-мишени при инфекции генотипа-3 в настоящее время неизвестны.

• Интерферонотерапия обладает иммуномодулирующими свойствами; Генотип-3a HCV более чувствителен к терапии на основе интерферона, чем генотип-1 HCV. Влияние интерферона на Т-клеточный иммунитет генотипа 3a неизвестно.

• Полиморфизм, связанный с

  IL28B, связан с устойчивым вирусологическим ответом при инфекциях с генотипом-1, но не с генотипом-3a; поэтому следует изучить альтернативные механизмы, объясняющие это наблюдение.

Какие новые выводы?

• В отличие от инфекции генотипа-1, ответы Т-лимфоцитов CD8, специфичные для генотипа 3а, обычно нацелены на неструктурные белки вируса гепатита С (ВГС) при хроническом заболевании.

• При хронической инфекции генотипа-3a ответы Т-хелперов нацелены на доминантный коровый белок ВГС.

• Т-клетки-мишени, идентифицированные во время хронической инфекции, могут иметь ограниченную роль в защитном иммунитете, поскольку они отличаются от мишеней, обнаруженных при спонтанно разрешенной инфекции, где преобладают Т-клетки CD4, нацеленные на неструктурные белки.

• Парадоксально, но генотип-3a-специфические Т-клеточные ответы и общее количество лимфоцитов снижаются во время лечения интерфероном в сочетании с устойчивым вирусологическим ответом.

Как это может повлиять на клиническую практику в обозримом будущем?

• Знание о генотипе-3a-специфическом Т-иммунитете поможет разработать рациональную вакцину против этого распространенного подтипа.

• Уменьшение количества Т-клеток при лечении в сочетании со снижением вирусной активности может служить ранним биомаркером интерфероновой чувствительности.

Введение

Вирус гепатита С (ВГС) — это глобально распространенный патоген, которым заражено 3% населения мира.1 Стойкая инфекция может быть связана с циррозом печени, гепатоцеллюлярным раком и смертью.2 ВГС проявляет высокую степень генетического разнообразия и может быть классифицирован по Филогенетический анализ на семь основных генотипов, которые имеют гомологию последовательностей примерно 80% на уровне аминокислот (аа), и на многочисленные подтипы.3 Филогенетический анализ показал, что ВГС существует у человека-хозяина в течение тысяч лет, что приводит к определенным генотипам, которые являются эндемичными. в разных географических точках.4 Однако за последние 100 лет ряд отдельных штаммов, в частности подтипы 1a, 1b и 3a, распространились по всему миру в результате эпидемии, связанной с медицинской практикой и внутривенным употреблением наркотиков.

С момента введения скрининга на ВГС в продуктах крови в Великобритании новые инфекции генотипа 1 стали менее распространенными, в то время как инфекция генотипа 3a стала относительно более распространенной, особенно среди иммигрантов с Индийского субконтинента и среди населения, употребляющего наркотики внутривенно.5 В Великобритании преобладающим штаммом в настоящее время является генотип-3a.6 Этот подтип также является эндемичным в некоторых частях Азии, Западной Европы и распространен (5-10%) в США, хотя здесь генотип-1 остается доминирующим штаммом. .

Классификация ВГС по вирусному генотипу оказалась очень информативной с точки зрения оценки глобальной вирусной эволюции и эпидемиологии, а также для прогнозирования ответа на схемы лечения на основе интерферона (IFN). Крупные рандомизированные клинические исследования неизменно показывают, что генотип-3a имеет более благоприятный исход лечения, чем инфекция генотипа-1.7 Причина этого не известна, но может иметь прямое отношение к вирусной последовательности, специфичной для генотипа, с дифференциальной способностью подавлять прямые противовирусные эффекты IFN. 8, 9 Недавние данные продемонстрировали, что генетический полиморфизм хозяина, связанный с IFN-λ, играет важную роль. ключевая роль в определении устойчивой эрадикации вируса с использованием терапии пегилированным интерфероном (Peg IFN) / рибавирином при генотипе-1, но не при инфекции генотипа-3.10, 11 В качестве альтернативы, поскольку IFN являются иммуномодулирующими, 12 и генотипы-1 и -3 имеют ограниченное количество При гомологии последовательностей различные исходы лечения могут относиться к эффектам терапии на генотип-специфичную функцию Т-клеток или на отдельный генотип-специфичный репертуар Т-клеток у инфицированных хозяев, гипотеза, которая в настоящее время не исследована.

В то время как ВГС-специфический Т-клеточный ответ на инфекцию генотипа-1 широко изучался в течение последнего десятилетия, очень мало известно о природе Т-клеточного ответа, нацеленного на другие генотипы. В то время как некоторые исследования включали пациентов с инфекцией генотипов-2 и -3, интерпретация этих исследований затрудняется тем фактом, что иммунологические анализы почти полностью полагались на пептиды генотипа-1, которые не отражают аутологичную циркулирующую вирусную инфекцию в организме хозяина.На сегодняшний день анализ ответов Т-клеток, специфичных для генотипа 3a, ограничен одним исследованием, в котором оценивались ответы на белок NS3.13 Это исследование, подкрепленное нашей недавней работой по оценке вирусного разнообразия, обусловленного человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA), между генотипами-1. и -3, показал, что существует вероятность ограниченной перекрестной реактивности Т-клеток между генотипами-1 и -3,14, 15

Детальный анализ генотипа-3a-специфического Т-клеточного иммунитета по всему геному до сих пор не проводился и, несомненно, важен как в контексте рациональной разработки вакцины, так и для дальнейшего понимания того, почему исход лечения схемами на основе ИФН зависит от генотипа.Поскольку в настоящее время в основных базах данных по ВГС доступно несколько вирусных последовательностей генотипа 3a, мы сначала выполнили анализ полноразмерных последовательностей в когорте инфицированных генотипом 3a, чтобы определить надежную и релевантную согласованную последовательность, и разработали соответствующий набор перекрывающихся последовательностей. пептиды для анализа Т-клеток. Затем оценивали ответы Т-клеток, специфичные для генотипа-3a, при хронической и спонтанно разрешенной инфекции и во время комбинированной терапии в сочетании с аутологичной вирусной последовательностью.

Методы

Полноразмерное геномное секвенирование генотипа-3a для создания набора пептидов генотипа-3a и секвенирование аутологичного вируса

Полноразмерное (aa 1-2929) вирусное секвенирование было выполнено у 20 не получавших лечения пациентов с генотипом 3a с хронической инфекцией (больница Джона Рэдклиффа, Оксфорд), как описано ранее. -скоростное центрифугирование (23 600 g в течение 1 ч) при 4 ° C. Вирусную РНК экстрагировали с использованием мини-набора для вирусной РНК QIAmp (Qiagen, Crawley, UK).Обратную транскрипцию и первый цикл ПЦР проводили в одной реакции (система Superscript III Onestep RT-PCR; фермент Platinum Taq (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)). В реакциях первого раунда амплифицировали продукт размером 4 т.п.н., кодирующий структурные белки Core, E1 и E2, и продукт размером 7 т.п.н., кодирующий неструктурные (NS2-5) белки. Во втором раунде ПЦР использовали ДНК-полимеразу High Fidelity Taq (Roche) во множестве вложенных реакций ПЦР (последовательности см. В Humphreys et al ).
16 в дополнение к праймерам NS5B 8848-Для 5′-TCC TGG TTR GGC AAC ATC ATC ATG TAC GC-3 ‘и 9428-Rev 5′-AAA TGG AGT GTT ATC CTA CCA GC-3’ и 9023-For 5 ‘ -GAC TCC ATG GTC TAA GCG CG-3 ‘и 9428-Rev).Фрагменты ПЦР очищали в геле (Qiagen) и двунаправленно секвенировали с использованием Prism Big Dye (Applied Biosystems, Warrington, UK) на автоматическом секвенаторе ДНК ABI 3100. Последовательности редактировали с помощью программного обеспечения X11. Номера доступа: GQ356200-GQ356215, GQ356217 и JF509175-JF509177.

Была определена консенсусная последовательность для получения набора пептидов генотипа-3а (длина 15-19 аминокислотных остатков, перекрытие 11 аминокислотных остатков, n = 460) (Mimotopes, Австралия). Перекрывающиеся пептиды J4 подтипа 1b и H77 подтипа 1a (15–19aa) были получены из ресурсов BEI.17 Все пептиды с C-концевыми аминокислотными остатками — G, P, E, D, Q, N, T, S, C — были либо укорачены, либо удлинены, чтобы гарантировать переносимость аминокислотных остатков на конце. 18 Пептиды объединяли в 10 пулов. соответствующие отдельным вирусным белкам: Core aa 1-191, E1 aa 192-383, E2 aa 384-752, p7 и NS2 aa 753-1032, домен протеазы NS3 aa 1033-1359, домен геликазы NS3 aa 1349-1663 , NS4 aa 1664-1978, NS5A aa 1979-2430, NS5B I aa 2431-2726 и NS5B II aa 2716-3021.

Разнообразие полноразмерной последовательности генотипа-3a

Разнообразие последовательностей оценивали с использованием полноразмерных последовательностей от 20 пациентов с хроническим генотипом-3a.Математическая мера энтропии была определена для каждой позиции аминокислоты с использованием инструмента Shannon Heterogenity In Alignments Tool V.1.0 (http://evolve.zoo.ox.ac.uk/software). 16 Филогенетическое дерево было построено с использованием программы MEGA5 в соответствии с к общему методу обратимости во времени и повторной выборке начальной загрузки, установленной на 1000 повторов.19 Последовательности выравнивали с помощью программы ClustalX V.2.0.12.

Клиническая группа

Было набрано восемьдесят пять пациентов, ранее не получавших лечения, 44 пациента с хроническим генотипом 1a / 1b, 31 хронический генотип 3a и 10 спонтанно разрешенных инфекций (антитела к ВГС + РНК отрицательны) (больница Джона Рэдклиффа, Оксфорд, Бартс и Лондонский фонд NHS Trust). , Лондон, Великобритания).Подгруппа из 21 пациента с генотипом-3a была обследована непосредственно перед лечением, во время и после терапии (пег IFN-α2b, 180 мкг / неделя и рибавирин 800-1200 мг / день в зависимости от массы тела в течение 24 недель). Было получено местное этическое одобрение, и все пациенты дали письменное информированное согласие. Ответ на лечение определяется с использованием стандартных определений7.

Анализ ELISpot

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяли и немедленно замораживали. Замороженные РВМС позволяли проводить одновременную оценку ответов Т-клеток, взятых в разные моменты времени.Размороженные PBMC тестировали с помощью анализов ELISpot IFN-γ (Mabtech, Nacka Strand, Швеция), как описано ранее.20 Вкратце, жизнеспособные PBMC (200 000 на лунку), посеянные в двух экземплярах, стимулировали в течение 18 часов пулами пептидов AM (3 мкг / лунку). мл), лизат цитомегаловируса (CMV) (0,05 мкг / мл, Chiron), эпитопы CD8 вируса гриппа, вируса Эпштейна-Барра (EBV) и CMV (FEC) в едином пуле (ресурсы BEI 3 мкг / мл). Пятнообразующие единицы (SFU) подсчитывали с использованием автоматического планшет-ридера ELISpot (AID). Для ELISpot генотипа 3a положительное пороговое значение 40 SFU / 10 ⁶ PBMC было определено у 12 здоровых добровольцев с использованием: (среднее SFU / 10 ⁶ PBMC в тестовых лунках — лунки с отрицательным контролем) + 3 × SD .Для генотипа-1 пороговое значение 43 SFU / 10 ⁶ было ранее определено у здоровых добровольцев с использованием идентичной стратегии. Общее количество лимфоцитов оценивали из 200 мкл крови до обработки и на 12-й неделе лечения с использованием автоматического гематологического анализатора Sysmex XE-2100 (Sysmex Corporation, Милтон-Кейнс, Великобритания).

Анализ субпопуляций Т-клеток и точное картирование антигенных мишеней

Для определения субпопуляций Т-лимфоцитов CD8 Т-клетки удаляли из РВМС с использованием разделения на магнитных шариках (CD8 Dynabeads, Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.CD8-отрицательные PBMC использовали в анализах IFN-γ ELISpot для картирования антигенных мишеней.

Т-клеточных линий и ICS

PBMC (5 × 10 ⁶ ) стимулировали 2,5 мкг / мл антигена с добавлением 50 МЕ / мл рекомбинантного интерлейкина 2 (дни 2, 5 и 8). После 10–14 дней культивирования линии Т-клеток выдерживали в течение 24 часов. Окрашивание внутриклеточных цитокинов (ICS) PBMC ex vivo и в краткосрочно стимулированных клеточных линиях выполняли, как описано ранее (Colloca et al
21).Вкратце, PBMC стимулировали с использованием специфических пептидов HCV или PMA / иономицина. Нестимулированные клетки служили отрицательным контролем. Через 6 часов клетки подвергали проницаемости и окрашивали с использованием следующих антител: CD3-PO, CD4-Qdot 605, CD8-PB, IFNγ-Alexa-Fluor700, IL2-APC, TNFα-PE-Cy7 и Mip1beta-PE. Проточную цитометрию выполняли с использованием BD LSRII, а анализ — с помощью FlowJo (V.8.8.6).

Статистический анализ

Т-клеток, нацеленных на структурные и NS вирусные области генома у пациентов с HCV генотипов-3 и -1, использовали точный тест Фишера.Величину ответа Т-клеток при хронической инфекции по сравнению со спонтанно разрешенной инфекцией, а также предварительное лечение в зависимости от результата лечения оценивали с помощью непарного двустороннего t-критерия. Для сравнения ответов Т-клеток с течением времени использовался парный t-критерий. Значение p <0,05 считалось значимым.

Результаты

Т-клетки при инфекции генотипа-3a преимущественно нацелены на NS-белки

Ранее мы показали при хронической инфекции генотипа-1, что HCV-специфические ответы CD8 Т-клеток редко выявляются ex vivo, хотя часто наблюдаются CD4-Т-клетки, нацеленные на множественные коровые эпитопы.22–27 Это исследование подтвердило предыдущие наблюдения; при инфекции генотипа 1 часто выявлялись ответы Т-клеток ex vivo, нацеленные на ядро ​​ВГС (23/44 пациента), тогда как слабые ответы, нацеленные на белки NS, можно было наблюдать только у 6/44 пациентов (рисунок 1A). В подгруппе из 12 пациентов с генотипом-1a ответы Т-клеток оценивали с использованием панели пептидов генотипа-1a и генотипа-1b. Ответы на NS-белки выявлялись редко, независимо от используемой пептидной панели (рисунок 1B). Напротив, Т-клетки, нацеленные на область NS, были легко обнаружены и значительно чаще встречались при инфекции генотипа-3 (6/44 пациентов с генотипом-1 против 12/31 пациентов, инфицированных генотипом-3, p = 0.0183) (рисунок 1C, D). Дополнительные ответы, нацеленные на ядро ​​HCV, могут быть обнаружены у 10/31 пациентов, инфицированных генотипом 3a (рисунок 1C).

фигура 1

Ответ Т-лимфоцитов, специфичный к вирусу гепатита С (HCV), интерферон (IFN) -γ, при хронической инфекции генотипов-1 и -3. Общая величина ВГС-специфических Т-клеточных ответов, измеренная с помощью анализа IFN-γ ELISpot (пятнообразующие единицы (SFU) / 10 ⁶ мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC)) у (A) пациентов с хронической инфекцией генотипа-1 с использованием пептиды генотипа-1b, (B) подмножество пациентов с хронически инфицированным генотипом-1a, использующих пептиды генотипов-1a и 1b, и (C) пациентов с генотипом-3a, использующих пептиды генотипа-3a.Ответы Т-клеток на отдельные части вирусного генома обозначены цветом. (D) Показан сравнительный анализ пациентов с хронической инфекцией генотипа-3a или -1, нацеленной на структурные и неструктурные вирусные области, по оценке IFN-γ ELISpot (p = 0,0183).

Картирование антигенных мишеней генотипа 3а при хронической инфекции

антигенных мишеней Т-клеток были идентифицированы с использованием отдельных пептидов в анализах IFN-γ ELISpot (таблица 1). Подкласс CD4: CD8 был определен с помощью анализов истощения CD8 IFN-γ ELISpot и подтвержден с помощью ICS ex vivo или с помощью ICS после генерации краткосрочных клеточных линий (рис. 2).У 11 из 15 пациентов с детектируемыми ответами и доступными клетками было идентифицировано 10 эпитопов Т-клеток генотипа-3а, из которых восемь являются новыми, включая доминантный ответ CD4 на ядро ​​ВГС (аа 143-158 PVGGVARALAHGVRAL) (у четырех пациентов с ответами на уровне порог срабатывания обнаружения не может быть отображен). Т-клеточные эпитопы, которые картированы с вирусными областями NS NS3 (а.о. 1513-1529 RPSGMFDSVVL), NS4b (а.о. 1791-1806 PAVASLMAFTASVTSPL, 1824-1841 THLAGPQSSSAFVVSGLA и 1918-1933 EGAVQWMNRLIAFASR), NS4BVK (NSGVQWMNRLIAFASR) 2963 GKAKICGLYLFNWAVRTK и 2965-2975 KLTPLPAAGQL) были ограничены исключительно CD8 Т-клетками.Ответы CD8, нацеленные на единственный эпитоп в геликазе NS3 (а.о. 1513-1529 RPSGMFDSVVL), были обнаружены у всех трех пациентов с HLA B3501 (эквивалентная вирусная область при инфекции генотипа 1 RPSGMFDS
S
VL — известный эпитоп B3501) 13.

Таблица 1

Эпитопы Т-клеток при инфекции генотипа-3a

фигура 2

Т-клеточных ответов оценивали с помощью ELISpot интерферона-γ и окрашивания внутриклеточных цитокинов (ICS). Репрезентативные ответы Т-клеток, обнаруженные с помощью анализа ELISpot на интерферон-γ при (A) инфекции, вызванной вирусом гепатита C (HCV), и (B) спонтанно разрешенной инфекции.Пример ELISpot истощения Т-лимфоцитов CD8 показан (C). Ex vivo ICS-анализ CD4-ответов на два ядерных пептида у хронических пациентов (пептидная последовательность в сером тексте) (D). ICS после генерации краткосрочных клеточных линий при хронической инфекции (pt 235) и спонтанной разрешенной инфекции (pt 568 и 861) (E). ЦМВ, цитомегаловирус; TNF, фактор некроза опухоли.

Анализ вирусной последовательности использовали для определения, представляет ли циркулирующая вирусная последовательность хозяина идентифицированные антигенные мишени Т-клеток.В 7 из 11 случаев вирусная последовательность хозяина была идентична антигенной мишени пептида Т-клеток. Однако аминокислотные различия между вирусной последовательностью хозяина и пептидными мишенями были обнаружены у четырех пациентов (таблица 1). У двух пациентов (129 и 450 нацеленных пептидов NS5a aa 2029-2046 и NS5b aa 2965-2975, соответственно) анализ Т-клеток с использованием вариантных и консенсусных пептидов в анализах IFN-γ ELISpot показал, что вариантный пептид привел к снижению или полной потере ответа Т-клеток.

Оценка вирусного разнообразия генотипа 3a

Чтобы гарантировать, что местная оксфордская когорта не представляет собой единственную вспышку и, таким образом, учесть легко обнаруживаемые ответы CD8 в области NS с использованием консенсусного пептида (рис. 3A), и поскольку имеются ограниченные данные о вирусной последовательности генотипа-3a, вирусном разнообразии оценивали в когорте генотипа-3a с использованием полноразмерных вирусных последовательностей.Филогенетический анализ показал значительное разнообразие, и эталонный штамм с генотипом 3a (инвентарный номер D28917) попал в кластер генотипа 3a Oxford. Карта энтропии показала, что значительные вирусные вариации наблюдались по всему вирусному геному, особенно в пределах E2, но также и в областях NS (рисунок 3B).

Рисунок 3

Разнообразие последовательностей полноразмерных последовательностей генотипа-3a. (A) Соседнее дерево полноразмерных нуклеотидных последовательностей от 20 хронических пациентов, инфицированных генотипом 3a, включая восемь пациентов, прошедших долгосрочную комбинированную терапию (зеленый = устойчивый вирусологический ответ, оранжевый = рецидив, красный = неответчики, генотип-3a консенсусная последовательность = синий).Также включены консенсусная последовательность пептида генотипа-3a, эталонная последовательность генотипа-3a (номер доступа D28917) вместе с нуклеотидной последовательностью H77 генотипа-1a (номер доступа AF009606), используемая в качестве внешней группы. Показаны оценки бутстрапа> 70%. (B) Показан показатель энтропии (мера вирусной изменчивости) по вирусному геному с использованием полноразмерных последовательностей генотипа-3a от 20 пациентов с хроническим генотипом-3a. Пептиды генотипа-3a, положительно идентифицированные с помощью анализов ELISpot на интерферон-γ при хроническом заболевании, показаны штриховыми серыми столбцами.Показана карта полипротеина вируса гепатита С, соответствующая приведенному выше графику энтропии.

Генотип-3a-специфические Т-клеточные ответы при спонтанно разрешенной инфекции

При спонтанно разрешенной инфекции Т-клеточные ответы (оцениваемые с помощью IFN-γ ELISpot / CD8 T-клеточного истощения и анализа ICS; рисунок 2) были обнаружены у всех лиц с разрешенной инфекцией (10/10 разрешенных против 16/32 хронических, p = 0,0045 ) (рисунок 4A). Общая средняя величина была значительно выше по сравнению с хронической инфекцией (197.4 ± 44,50 разрешено, 139,8 ± 48,70 — хроническое, p = 0,02 (исключая pt 3001) (рисунок 4C). В отличие от ответов, наблюдаемых при хронических заболеваниях, ответы на NS-белки ограничивались CD4-T-клетками, и основной ответ CD4 HCV, который доминировал при хронической инфекции, не обнаруживался. Никаких ответов не было обнаружено в подгруппе из пяти пациентов, которые также были протестированы с набором пептидов генотипа-1b (фигура 4В), демонстрируя ограниченную межгенотипическую перекрестную реактивность. Антигенные мишени Т-клеток у пациентов с разрешенной инфекцией подробно описаны в таблице 2.

Рисунок 4

Ответ Т-лимфоцитов, специфичный к вирусу гепатита С (HCV), интерферон (IFN) -γ при спонтанно разрешенной инфекции. Общая величина ВГС-специфических Т-клеточных ответов, измеренная с помощью анализа IFN-γ ELISpot (пятнообразующие единицы (SFU) / 10 ⁶ мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC)) у пациентов со спонтанно разрешенной инфекцией ВГС с использованием генотипа (A) -3a и (B) генотип-1b пептиды HCV. Ответы Т-клеток на отдельные части вирусного генома обозначены цветом. (C) Показан сравнительный анализ величины ответов пациентов с хронической инфекцией и спонтанными резольверами по оценке IFN-γ ELISpot (p = 0.0239).

Таблица 2

Пептиды генотипа-3a, идентифицированные в спонтанных резолверах

Перекрестная реактивность Т-мишеней генотипа-3a и -1

Наша предыдущая работа с использованием подхода на основе вирусного секвенирования в сочетании с типом HLA предсказывала небольшую перекрестную реактивность между CD8 T-клетками, нацеленными на генотипы-1 и -3.28. побег. Напротив, консенсусные пептиды могут обнаруживать относительно консервативные антигенные мишени.Во всех случаях, когда оценивалась перекрестная реактивность, эквивалентная вирусная область при инфекции генотипа-1 отличалась от эпитопов Т-клеток генотипа-3 (таблица 3). Используя пептиды, полученные из эквивалентных областей в генотипе-1, мы показываем, что во всех случаях (за исключением NS5a aa 2029-2046) наблюдалась полная потеря или снижение распознавания Т-клеток. В эпитопе генотипа 3a KLTPLPAAGQL NS5b, где циркулирующий вирусный вариант хозяина (KLTPLPAAG L L, таблица 1) приводил к потере узнавания, эквивалентные вирусные области генотипа 1 отличались от последовательности генотипа 3a тем же остатком (KLTPIAAAG R L и KLTPLIAAG S L), и межгенотипическое перекрестное распознавание было отменено.

Таблица 3

Перекрестная реактивность генотипа-3a и -1 пептида

Хотя DRB1 * 0103 и DRB1 * 1101 ограниченные CD4 Т-клетки, нацеленные на аа 143–158, были ранее описаны при инфицировании генотипа-1, 29–31 существует значительное расхождение последовательностей между генотипами-1 и -3 в этой области (PVGGVARALAHGVRAL vs GAPLGAVARALAHGVRVL ). Здесь было обнаружено, что доминантный ответ Т-лимфоцитов CD4, нацеленный на коровый эпитоп генотипа-3а (аа143-158), является относительно генотип-3а-специфичным в том смысле, что эквивалентная вирусная область генотипа-1 плохо распознается.

Генотип-3a ВГС-специфические Т-клеточные ответы снижаются во время комбинированной терапии

Двадцать один пациент, инфицированный генотипом-3a, находился под длительным наблюдением во время стандартного лечения с 6-месячным курсом PEG-IFN-α и рибавирином для проверки гипотезы о том, что терапия может усиливать генотип-3a-специфический Т-клеточный иммунитет и учитывать предпочтительный ответ на лечение ставки в этом генотипе (рисунок 5). Из 21 пациента 14 (67%) достигли стойкого вирусологического ответа (УВО), 5 (24%) испытали вирусологический рецидив и 2 (9%) не ответили на лечение (НР).До лечения 8/14 пациентов с УВО имели детектируемые ВГС-специфические Т-клеточные ответы со средней общей величиной 180 SFU / 10 ⁶ PBMC (рисунок 5A). Это было выше, чем у пациентов без УВО, где ответы наблюдались только у двух пациентов со средней общей величиной 32 SFU / 10 ⁶ Т-клеточных ответов PBMC (p = NS, рисунок 5B).

Рисунок 5.

Влияние комбинированной терапии на Т-клеточные ответы, специфичные для вируса гепатита С (ВГС), у пациентов с генотипом 3а с устойчивым вирусологическим ответом (УВО) (А) и без УВО (В).Общая величина генотипа-3a HCV-специфического ответа Т-клеток, измеренная с помощью анализа IFN-γ ELISpot у пациентов с хроническим генотипом-3a. Т-клеточные ответы на пептиды генотипа-3a HCV измеряли до лечения и в различные моменты времени во время лечения и после лечения. Пациенты, достигшие УВО, показаны на левой панели (черные символы), а пациенты, не достигшие УВО, показаны на правой панели (красные символы). Каждый пациент представлен отдельным символом. Порог положительных HCV-специфических ответов представлен пунктирной линией (40 пятнообразующих единиц (SFU) / 10 ⁶ мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC)), определенный для здоровых контролей (см. Методы).Показана продолжительность лечения 24 недели.

У пациентов с УВО общий HCV-специфический Т-клеточный ответ, выявленный до лечения, явно снизился во время терапии (среднее значение до лечения 180 SFU / 10 ⁶ PBMC против 26 SFU / 10 ⁶ PBMC на 8–12 неделе; р = 0,0337) (рисунок 5А). В целом, ответы снова увеличились после лечения, когда вирус оставался неопределяемым, что позволяет предположить, что снижение было не просто из-за снижения уровня виремии.

У трех пациентов новые слабые ВГС-специфические Т-клеточные ответы были впервые обнаружены через 3–6 месяцев после окончания терапии (2 пациента с УВО и 1 пациент без УВО).Этот феномен наблюдался при инфекции генотипа 1 с увеличением пролиферативной и цитотоксической способности как у пациентов с УВО, так и у пациентов без УВО к концу терапии и, по-видимому, не связан с исходом лечения.30, 32

Другие вирус-специфические Т-клеточные ответы снижаются во время терапии ИФН и рибавирином

Чтобы определить, применяется ли уменьшение величины Т-клеточных ответов во время лечения только к ВГС-специфическим Т-клеткам, Т-клеточные ответы на другие вирусные антигены (грипп, ВЭБ и ЦМВ HLA CD8-ограниченные эпитопы Т-лимфоцитов и лизат ЦМВ, который в первую очередь индуцирует CD4 Т-клетки).

Ответы на грипп / EBV / CMV до лечения были обнаружены у 16 ​​пациентов (10 SVR, 5 REL, 1 NR-величина, диапазон 195–1530 SFU / 10 ⁶ PBMC) (рис. 6). У пациентов с УВО они уменьшались по величине на протяжении лечения и были значительно ниже во все моменты времени во время лечения по сравнению с предварительным лечением (величина TW4-6, TW8-12 и TW24 по сравнению с предварительным лечением p = 0,0136, p = 0,0326, p = 0,0187 соответственно) (рисунок 6А). После лечения величина ответов увеличилась до уровней до лечения.Напротив, ответы пациентов с NR существенно не изменились во время лечения (фигура 6B). Аналогичным образом, ответы лизата ЦМВ до лечения также снизились по величине во время лечения у пациентов с УВО, но не достигли статистической значимости (данные не показаны).

Рисунок 6

Влияние комбинированной терапии на Т-клеточные ответы гриппа, вируса Эпштейна-Барра и цитомегаловируса (CMV) (ЦМВ), а также общее количество лимфоцитов у пациентов с устойчивым вирусологическим ответом (УВО) и пациентов без УВО.Общая величина специфичных для FEC и HCV Т-клеточных ответов IFN-γ, измеренная с помощью анализа ELISpot у пациентов с хроническим генотипом-3a. Ответы на пептиды, ограниченные FEC HLA класса I, измеряли до лечения, в различные моменты времени во время лечения и после лечения. (A) Пациенты, достигшие УВО, показаны на левой панели (черные символы), и (B) пациенты, не получившие лечения, показаны на правой панели (красные символы). Порог положительных ответов, специфичных для вируса гепатита C (HCV), представлен пунктирной линией (40 пятнообразующих единиц (SFU) / 10 ⁶ мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC)), определенных для здоровых контролей (см. Методы).Показана продолжительность лечения 24 недели. (C) Процентное изменение количества лимфоцитов до лечения к 12 неделе комбинированной терапии у 22 пациентов, хронически инфицированных генотипом HCV-3a. Уровень предварительной обработки, установленный на 100%, показан пунктирной линией. Пациенты, достигшие УВО через 6 месяцев после лечения, показаны черными кружками, пациенты с рецидивом показаны красными треугольниками, а пациенты, не ответившие на лечение, показаны красными квадратами. Статистическая значимость, измеренная с помощью непарного t-критерия, обозначена значением p <0,05. Не-УВО = пациенты с рецидивом и без ответа.

УВО с IFN-α и рибавирином ассоциирован с тотальной лимфопенией

Поскольку величина Т-клеточного ответа на ВГС, грипп, ВЭБ и ЦМВ снизилась во время лечения у восьми пациентов с УВО, было оценено влияние лечения на общее количество лимфоцитов у 21 пациента с генотипом 3а (14 УВО, 5 УВО, 3 НР ). Величина общего количества лимфоцитов до лечения не была связана с исходом лечения (данные не показаны). Влияние лечения на количество лимфоцитов оценивали путем измерения процентного изменения общего количества лимфоцитов до лечения к 12 неделе лечения (фигура 6С).Общее количество лимфоцитов снизилось на 50% у пациентов с УВО и рецидивом, но снизилось только до 90% от уровней до лечения у пациентов с НР (УВО по сравнению с НС p = 0,0010).

Обсуждение

В то время как Т-клеточный иммунитет к инфекции генотипа 1 ВГС широко изучен и, по-видимому, играет ключевую роль в клиническом исходе, очень мало известно о Т-клеточном иммунитете к другим вирусным подтипам. Это исследование фокусируется на инфекции генотипа 3a HCV, которая в настоящее время является доминирующим подтипом инфекции в Великобритании и на большей части Азии, 33 и оценивает Т-клеточный иммунитет, нацеленный на весь полипротеин генотипа 3a, в сочетании с анализом вирусной последовательности и результатами лечения.Поскольку известно, что интерфероны модулируют функцию Т-клеток, и поскольку гомология вирусов между разными генотипами приближается к 80%, вполне вероятно, что интерфероны вызывают особый ответ Т-клеток при инфекции генотипа-3а, что по крайней мере частично объясняет различные результаты лечения.

Поскольку для основных частей полипротеина было доступно очень мало данных о вирусных последовательностях генотипа 3a, мы первоначально выполнили анализ полноразмерных вирусных последовательностей у 20 пациентов, инфицированных генотипом 3a, ранее не получавших лечения. Это позволило создать репрезентативный набор пептидов генотипа-3a.Мы обнаружили, что HCV-специфические Т-клеточные ответы были легко обнаружены примерно у половины пациентов с хронической инфекцией генотипа-3a, при этом субпопуляции CD4 T-клеток нацелены на основной белок, а CD8 T-клетки нацелены на NS-белки HCV. Это значительно отличалось от заражения генотипом-1, где обнаруживаемые ответы почти исключительно нацелены на ядро. Частично это можно объяснить смешанными популяциями подтипа 1a / -1b, хотя тестирование с панелями гомологичных пептидов 1a / 1b не увеличивало обнаружение NS-ответов.

Ответы ядра CD4 генотипа-3a были сопоставлены с аминокислотами 143-158; ПВГГВАРАЛАХГВРАЛ в 4/5 корпусах. «Эквивалентный» пептид генотипа-1a, который отличается двумя аминокислотами, известен как Т-мишень CD4, ограниченная DRB1 1101.31 Напротив, при инфекции генотипа-1 известно, что Т-клетки CD4 нацелены на широкий спектр эпитопы в ядре.23, 24, 34 Анализ вирусной последовательности у 4/5 пациентов не показал доказательств утечки вируса, подтверждающих предыдущие данные у людей, 23 и шимпанзе, 35, показывая, что CD4 T-клетки в отличие от CD8 T-клеток редко оказывают давление отбора на HCV.При разрешенной инфекции основные ответы не были обнаружены, что позволяет предположить, что они могут представлять собой ответы с низкой авидностью, которые возникают после установления хронической инфекции.

Там, где был возможен анализ субпопуляции Т-клеток, мы показали, что NS-белки генотипа-3a были нацелены исключительно на Т-клетки CD8 при хронической инфекции, тогда как при разрешенной инфекции также обнаруживались Т-клетки CD4. Это наблюдение согласуется с предыдущими исследованиями, которые демонстрируют важность подмножества CD4 в вирусном контроле.31 Внутрипеченочный Т-клеточный иммунитет не оценивался; В то время как Т-клетки, оцениваемые в периферическом компартменте, как полагают, отражают внутрипеченочный Т-клеточный иммунитет, более высокие уровни ВГС-специфических Т-клеток наблюдаются в печени, и мы не можем исключить возможность того, что субпопуляции Т-клеток в печени различаются между генотипами. 37

При хронической инфекции описаны девять эпитопов генотипа-3a, нацеленных на ядро ​​и NS3-NS5b. Интересно, что четыре (NS4b 1791-1806, NS4b 1918-1933, NS5b 2946-2963, NS5b2965-2975) из них, идентифицированных как Т-клеточные эпитопы CD8, перекрываются с Т-клеточными эпитопами CD4 в неидентичных, но эквивалентных вирусных областях генотипа-1a.29, 31, 38, 39 Только в одном эпитопе вирусная последовательность генотипа-3а была идентична последовательности, обнаруженной при инфекции генотипа-1а. Большинство эпитопов генотипа-3a, оцениваемых на перекрестную реактивность, показали небольшую перекрестную реактивность или отсутствие перекрестной реактивности с эквивалентными антигенами генотипа-1, показывая, что большинство Т-клеток-мишеней при инфекции генотипа-3a являются субтип-специфичными.

Затем мы оценили влияние комбинированной терапии на ответы, специфичные для генотипа 3a. Влияние терапии на ВГС-специфические Т-клеточные ответы было областью исследований и противоречий в течение нескольких лет при инфекции генотипа-1, но не изучено при инфекции генотипа-3а, за исключением одного исследования, предполагающего, что пролиферативные ответы на NS3 усиливаются в генотип-3 во время лечения.40 Как именно терапия влияет на противовирусные Т-клеточные ответы, осложняется тем фактом, что IFN обладает как прямым противовирусным действием, так и широким спектром иммуномодулирующих свойств. Несопоставимые результаты при инфицировании генотипом-1 могут быть объяснены техническими проблемами, такими как слабые Т-клеточные ответы на пределе обнаружения иммунологических анализов, а также тем фактом, что пептиды использовались в анализах, которые не отражают циркулирующий вирусный штамм. Исследования показали, что Т-клеточные ответы, не обнаруживаемые до начала терапии, могут быть обнаружены во время терапии, по крайней мере, у некоторых людей, 30, 41, что формирование ответа типа Th2 во время терапии связано с SVR42 и что уровень HCV-специфичности до лечения иммунитет связан с УВО.32, 43 В подтверждение последнего мы отметили, что общие ВГС-специфические Т-клеточные ответы до лечения были выше, чем у пациентов с НР; однако это не достигло статистической значимости. Другие предположили, что терапия IFN-α может на самом деле приводить к снижению ВГС-специфических Т-клеточных ответов, но не Т-лимфоцитов, нацеленных на антигены, не относящиеся к ВГС, и что эти ответы остаются необнаруживаемыми у пациентов с УВО, что предполагает в ответе на ВГС отражает снижение вирусной нагрузки ВГС44.

В этом исследовании инфекции генотипа-3a мы показываем, что ВГС-специфические Т-клеточные ответы, которые можно обнаружить до терапии, значительно снижаются во время терапии у лиц с последующим УВО, но восстанавливаются после прекращения приема ИФН.У пациентов, у которых нет УВО, снижение специфических для ВГС ответов не наблюдается. Однако такая же картина наблюдается и в ответах Т-клеток, не связанных с HCV, что свидетельствует об общем ответе хозяина на лечение IFN. Более того, когда эти наблюдения расширены, чтобы включить общее количество лимфоцитов, становится очевидным, что лимфопения при инфекции генотипа-3а специфически связана с УВО для комбинированной терапии, тогда как лечебные НО устойчивы к лимфопении, индуцированной лечением. Механизм лимфопении, индуцированной IFN, неизвестен, но может отражать перераспределение Т-клеток.Тот факт, что общее количество лимфоцитов и неспецифических Т-лимфоцитов снижается специфически у пациентов с последующим УВО, но восстанавливается после прекращения лечения, несмотря на неопределяемую виремию, предполагает, что снижение ВГС-специфических Т-клеточных ответов мало связано с изменения вирусной нагрузки ВГС. Более вероятно, что хозяева, инфицированные генотипом 3a, которые не реагируют на лечение, демонстрируют доказательства общей устойчивости хозяина к эффектам терапии IFN. Недавние данные, показывающие, что генетические полиморфизмы, связанные с геном IL28B, определяют исход лечения терапией IFN, убедительно подтверждают концепцию, что генетика хозяина играет ключевую роль в клиническом исходе инфекции.Возможно, что гены, стимулированные IFN, вызывают периферическую лимфопению, а также успешно уничтожают вирус в организме хозяина. Безусловно, есть данные, подтверждающие идею о том, что гены, стимулированные IFN, стимулируются в PBMC у людей, получавших IFN.45 Альтернативно, предварительно активированная система IFN, индуцированная вирусными белками, которая, как известно, связана с неспособностью реагировать на экзогенный IFN, может каким-то образом делают хозяина устойчивым к лимфопении, индуцированной экзогенным IFN.

В заключение, наши данные демонстрируют, что генотип 3a HCV проявляет отчетливую Т-клеточную специфичность.При хронической инфекции Т-клетки CD4, нацеленные на структурные белки, и Т-клетки CD8, нацеленные на белки NS, легко обнаруживаются, в то время как Т-клетки CD4, нацеленные на белки NS, связаны со спонтанным вирусным контролем. Анализ вирусной последовательности показал доказательства ускользания вируса от Т-лимфоцитов CD8, но не из Т-лимфоцитов CD4. Парадоксально, но успешный результат лечения инфекции генотипа-3a был связан со снижением количества ВГС и неспецифических Т-лимфоцитов, а также со снижением общего количества лимфоцитов.

Рекомбинантная форма HCV 2k / 1b среди пациентов с генотипом 2, инфицированных гепатитом C, в Джорджии

Abstract Body

Предпосылки: Первая рекомбинантная форма ВГС, RF2k / 1b, была первоначально описана в России и с тех пор была идентифицирована у пациентов в Ирландии, Франции, Эстонии, Узбекистане и на Кипре. Многие из этих пациентов были родом из Грузии. Исследования полного секвенирования генома показали, что эта форма разделяет структурную часть генома HCV из генотипа 2 и неструктурную часть из генотипа 1.Поскольку рутинным методом идентификации генотипа в Джорджии является набор Versant HCV Genotype v2, который усиливает структурные области Core и 5’UTR, нуклеотидные последовательности в неструктурных областях будут упущены. Поэтому мы провели небольшое исследование для сравнения двух геномных области HCV с целью идентификации рекомбинантной формы HCV.

Методы: мы ретроспективно секвенировали неструктурную область 5B (NS5B) ВГС в образцах остатков, собранных у 72 инфицированных ВГС грузинских пациентов с генотипами, ранее определенными с помощью набора Versant HCV Genotype v2 как: 32 (44.4%) генотип 1, 21 (29,1%) генотип 2 и 19 (26,3%) генотип 3. Из этих пациентов тридцать шесть пациентов прошли лечение PEG / RBN.

Результаты: Часть области NS5B была секвенирована среди всех 72 образцов, с согласованными неструктурными / структурными результатами для большинства образцов генотипа 1 и всех образцов генотипа 3. Из 21 образца с генотипом 2 16 показали сходство с генотипом 1b. Филогенетическое дерево показывает, что 15 последовательностей дискордантных последовательностей образовали кладу с референсными последовательностями RF2k / 1b, выбранными из разных стран.