Определение гепатита с методом пцр: качественный и количественный анализ крови, расшифровка результатов

Анализ на вирус гепатита С (ИФА и ПЦР)

Антитела к вирусу гепатита С ( суммарные)

Антитела к вирусу гепатита С в сыворотке в норме отсутствуют

Суммарные антитела к вирусу гепатита С представляют собой антитела классов IgM и IgG, направленные к комплексу структурных и неструктурных белков вируса гепатита С.

Это исследование является скрининговым для выявления пациентов с ВСГ. Суммарные антитела к вирусу гепатита С можно выявить в первые 2 недели заболевания, и их присутствие свидетельствует о возможной инфицированности вирусом или перенесенной инфекции.

Однозначный ответ на основании результатов данного теста получить невозможно, так как тест определяет суммарные антитела IgM и IgG. Если это ранний период острого вирусного гепатита С, то об этом свидетельствуют антитела IgM, а если это период реконвалесценции или состояние после перенесенного ВГС, то на это указывают антитела IgG.

Антитела IgG к ВГС могут сохраняться в крови реконвалесцентов на протяжении 8-10 лет с постепенным снижением их концентрации. Возможно позднее обнаружение антител спустя год и более после инфицирования. При хроническом гепатите С суммарные антитела определяются постоянно. Поэтому для уточнения сроков инфицирования необходимо отдельно определить антитела класса IgM к ВГС.

Оценка результатов исследования

Результат исследования выражается качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие суммарных антител (JgM и JgG) к ВГС в сыворотке крови. Положительный результат – выявление суммарных антител (JgM и JgG) к ВГС свидетельствует о начальной стадии острого вирусного гепатита С, остром периоде инфекции, ранней стадии реконвалесценции, перенесенном вирусном гепатите С или хроническом вирусном гепатите С.

Однако обнаружение суммарных антител к ВГС недостаточно для постановки диагноза ВГС и требует подтверждения для исключения ложноположительного результата исследования. Поэтому при получении положительного результата скринингового исследования на суммарные антитела к ВГС в лаборатории проводится подтверждающий тест. Окончательный результат определения суммарных антител к ВГС выдается совместно с результатом подтверждающего теста.

Антитела к вирусу гепатита С JgM

Антитела к вирусу гепатита С JgM в сыворотке в норме отсутствуют. Наличие антител класса JgM к ВГС в крови пациента позволяет верифицировать активную инфекцию. Антитела класса JgM могут выявляться не только при остром ВГС, но и при хроническом гепатите С.

Антитела класса JgM к ВГС появляются в крови пациента спустя 2 недели после развития клинической картины острого вирусного гепатита С или обострения хронического гепатита и обычно исчезают спустя 4-6 месяцев. Снижение их уровня может свидетельствовать об эффективности лекарственной терапии.

Оценка результатов исследования

Результат исследования выражается качественно – положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие антител JgM к ВГС в сыворотке крови. Положительный результат – выявление антител JgM к ВГС свидетельствует о начальной стадии острого вирусного гепатита С, остром периоде инфекции, ранней стадии реконвалесценции или активном хроническом вирусном гепатите С.

Обнаружение вируса гепатита С методом ПЦР (качественно)

Вирус гепатита С в крови в норме отсутствует.

В отличие от серологических методов диагностики ВГС, где обнаруживают антитела к ВГС, ПЦР позволяет выявить наличие непосредственно РНК ВГС в крови как качественно, так и количественно. Определяемым фрагментом в обоих служит консервативный участок генома гепатита С.

Обнаружение только антител к ВГС подтверждает лишь факт инфицирования пациента, но не позволяет судить об активности инфекционного процесса (о репликации вируса), о прогнозе заболевания. Кроме того, антитела к вирусу ГС обнаруживают как в крови больных острым и хроническим гепатитом,так и у тех пациентов, кто болел и выздоровел, а нередко антитела в крови появляются только спустя несколько месяцев после появления клинической картины заболевания, что затрудняет диагностику. Обнаружение вируса в крови методом ПЦР – более информативный метод диагностики.

Качественное выявление ВГС методом ПЦР в крови свидетельствует о виремии, позволяет судить о размножении вируса в организме и является одним из критериев эффективности противовирусной терапии.

Аналитическая чувствительность метода ПЦР составляет не менее 50-100 вирусных частиц в 5 мкл, прошедшей выделение ДНК-пробы, специфичность – 98%. Обнаружение РНК вируса гепатита С с помощью ПЦР на ранних этапах развития вирусной инфекции (возможно уже через 1-2 недели после заражения) на фоне полного отсутствия каких-либо серологических маркеров может служить самым ранним свидетельством инфицирования.

Однако изолированное выявление РНК вируса гепатита С на фоне полного отсутствия каких-либо других серологических маркеров не может полностью исключить ложноположительный результат ПЦР. В таких случаях требуется всесторонняя оценка клинических, биохимических и морфологических исследований и повторное неоднократное подтверждение наличия инфекции ПЦР.

Согласно рекомендациям ВОЗ для подтверждения диагноза вирусного гепатита С необходимо троекратное выявление РНК вируса гепатита С в крови пациента.

Обнаружение РНК вируса гепатита С методом ПЦР используется в целях:




• разрешения сомнительных результатов серологических исследований;
• дифференциация гепатита С от других форм гепатита;
• выявление острой стадии заболевания по сравнению с перенесенной инфекцией или контактом; определения стадии инфицированности новорожденных от серопозитивных по вирусу гепатита С матерей;
• контроля эффективности противовирусного лечения.

Обнаружение вируса гепатита С методом ПЦР (количественно)

Количественный метод определения содержания РНК вируса гепатита С в крови дает важную информацию об интенсивности развития заболевания, об эффективности лечения и о развитии резистентности к антивирусным препаратам. Аналитическая чувствительность метода составляет от 5. 8 копий /мл – высокий.

Количественное определение содержания РНК ВГС в сыворотке крови методом ПЦР имеет важное значение для прогноза эффективности лечения интерфероном-альфа. Показано, что наиболее благоприятный прогноз заболевания и наибольшую вероятность положительного ответа на противовирусную терапию имеют лица с низким уровнем виремии. При эффективном лечении уровень виремии снижается.

Генотипирование вируса гепатита С — определение генотипа

Метод ПЦР позволяет не только выявить РНК ВГС в крови, но и установить его генотип. Наиболее важное значение для клинической практики имеют 5 субтипов ВГС – 1а, 1b, 2а, 2b и 3а. В нашей стране наиболее часто встречается субтип 1b, далее идут 3а, 1а, 2а.

Определение генотипа (субтипа) вируса имеет важное значение для прогноза течения ВГС и подбора пациентов с хроническим ВГС к проведению лечения интерфероном-альфа и рибавирином.

При инфицировании пациента субтипом 1b хронический ВГС развивается примерно в 90% случаев, при наличии субтипов 2а и 3а – в 33-50%. У пациентов с субтипом 1b заболевание протекает в более тяжелой форме и часто заканчивается развитием цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. При инфицировании субтипом 3а у больных более выражен стеатоз, поражение желчевыводящих путей, активность АЛТ и менее выражены фиброзные изменения в печени, чем у пациентов с субтипом 1b.

Показаниями к лечению хронического ВГС интерфероном–альфа являются:




• повышение уровня трансаминаз;
• наличие РНК ВГС в крови;
• генотип 1 ВГС;
• высокий уровень виремии в крови;
• гистологические изменения в печени: фиброз, умеренные или выраженные воспалительные явления.

При лечении интерфероном-альфа больных вирусным гепатитом С с субтипом 1b эффективность терапии отмечается в среднем в 18% случаев, у инфицированных другими субтипами – в 55%. Использование комбинированной схемы лечения (интерферон-альфа + рибавирин) повышает эффективность терапии. Стойкий ответ наблюдается у 28% больных с субтипом 1b и у 66% — с другими субтипами ВГС.

что это такое, разновидности и расшифровка

Проведение анализов на ПЦР гепатита С позволяет определить конкретную структуру вируса, выяснить, какими особенностями обладают его генетические материалы, и какое значение они имеют в общей биологической структуре организма. Название ”ПЦР” относится, в первую очередь, к основному способу проведения такого обследования.

Проведение анализов на ПЦР гепатита С позволяет определить конкретную структуру вируса

Что такое ПЦР

Метод ПЦР, который может называться также методом HCV, используется в нескольких случаях:

1. У больного возникли симптомы, указывающие на то, что его печень воспалена.
2. Ранее опасность возникновения гепатита уже была отмечена, и пациент проходит плановый профилактический осмотр.
3. Необходимо определить наличие вируса в крови людей, недавно контактировавших с больным.
4. Если больной страдает от нескольких видов гепатита сразу и необходимо выяснить, какой именно из них является ключевым и приносит наибольший вред организму. Определение РНК вируса методом ПЦР позволит в этом случае начать единственно правильное лечение.
5. Необходимо определить, насколько активно развивается вирус, если ранее было определено его наличие в организме.
6. У больного возникли симптомы, указывающие на развитие цирроза печени.
7. Необходимо отследить, какое влияние на организм больного производит назначенное ранее и начатое лечение.
8. Есть вероятность скрытого течения болезни.
9. Необходимо проверить, сохранились ли следы заболевания в организме после выздоровления.

Анализ крови ПЦР при гепатите С: что такое он может дать при исследовании? В первую очередь, он позволит определить наличие заболевания самого по себе. Кроме того, такая диагностика дает возможность:

• выяснить основную проблему, если больной страдает от нескольких видов гепатита;
• подобрать наиболее адекватную заболеванию схему лечения;
• определить, есть ли опасность заражения после контакта с больным.

Если в крови пациента не обнаружено признаков PHK гепатита (HCV), значит, заражения не произошло. В свою очередь наличие такого генетического материала практически всегда означает необходимость дополнительных анализов. Они позволят определить то, насколько сильно развилась болезнь.

Разновидности исследований методом ПЦР

Порой на ранних стадиях заболевания анализ не даёт никакого результата, хоть в крови всё равно есть антитела, указывающие на развитие гепатита. Это требует дополнительного гибридизационно-флуоресцентного ПЦР-исследования, которое позволяет получить значительно более точные результаты. Это обеспечивает его высокая чувствительность.

Помимо этого, сдать анализ ПЦР РНК (HCV) можно также в двух разных вариантах:

1. Качественное исследование. Такой вид анализов указывает на то, содержит ли вообще кровь вирус гепатита. Он позволяет определить заболевание даже на ранних стадиях. Порой качественное исследование ПЦР совмещают с другими аналогичными анализами, если результаты кажутся неточными.
2. Количественный анализ на гепатит. Этот тест часто проводится после того, как качественный уже дал положительный результат. Он необходим для определения того, какой именно процент крови содержит следы вируса.

Диагностика такого типа считается достаточно точной и безопасной. При сдаче крови необходимо соблюдать обычные правила:

Перед сдачей анализа ПЦР надо отказаться от алкоголя и курения

• обращаться в лабораторию натощак;
• за трое суток до сдачи крови рекомендуется отказаться от любой вредной пищи, в том числе, сладких, острых, маринованных и жирных продуктов, белого хлеба и выпечки;
• отказаться от алкоголя и курения;
• отказаться от крепкого чая и кофе;
• отказаться от приёма лекарств, в том числе тех, которые необходимо использовать регулярно из-за того или иного хронического заболевания (если по какой-то причине прервать курс никак нельзя хотя бы на короткий срок, необходимо предупредить лечащего врача, возможно, придется немного изменить обычную дозу).

При точном соблюдении этих правил сдачи венозной крови, можно быть практически уверенным, что полученный результат окажется максимально точным и отразит все особенности состояния пациента.

Необходимо также предупреждать специалиста, занимающегося лечением, обо всех хронических заболеваниях, вредных привычках, возможной беременности и других особенностях анамнеза. Даже если по каким-то причинам это кажется неудобным, избегать этого ни в коем случае нельзя, иначе терапия может пойти по неправильному пути.

Количественный ПЦР

ПЦР количественный позволяет определить то, какое количество вируса уже находится в организме. Конкретно он определяет количество РНК вируса гепатита С в кубическом сантиметре крови. Единицами измерения в этом случае выступает МЕ/мл. МЕ в этой системе – международная единица.

Количественным методом ПЦР гепатит С анализируется в следующих случаях:

• в самом начале заболевания для определения того, как далеко оно зашло;
• в конце 3 месяца терапии, чтобы определить, насколько действенной она оказалась.

Такой ПЦР-реакцией специалисты выясняют также следующее:

1. Уровень того, насколько заразен больной.
2. То, насколько далеко зашло заболевание.
3. Наиболее адекватные методы лечения.
4. Необходимый срок лечения.

Помимо него существует также и качественный вид исследования.

Качественный

На гепатит С качественный анализ проводится в некоторых случаях:

• на начальном этапе заболевания для определения его наличия;
• после того как пациент переболел, и необходимо определить, что в его крови не осталось следов заболевания;
• при необходимости определения того, насколько пациент заразен для контактирующих с ним людей.

Качественный анализ может указать только на то, содержится ли в анализе крови вирус. В отдельных случаях ПЦР может не дать достоверного результата: например, тогда, когда процент вируса крайне низок.

Генотипирование используется для определения того, каким конкретно вирусом заражён больной

Генотипирование

Этот способ анализа используется для определения того, каким конкретно вирусом заражён больной. На данный момент в мире их существует 11, при этом на территории России наиболее популярны только три вирусных генотипа.

Поскольку для каждого возбудителя необходима собственная схема лечения и период, который больной должен избегать плотных контактов с другими людьми, это крайне важная методика. Избегать её нельзя – иначе излечение может быть значительно затруднено. Особенно он важен тем пациентам, у кого заболевание нетипичное для данной географической местности.

В отдельных случаях генотипирование также становится важным указателем на состояние печени: гепатит 3 типа часто вызван стеатозом, и его развитие соответствует ухудшению состояния печени.

Расшифровка

Расшифровка ПЦР-анализа позволяет определить некоторые особенности заболевания. В её основе лежат следующие сведения:

1. Наличие самого диагноза. Определяется качественным видом анализа показателей крови. Обычно помечается просто ”Найдено” или ”Не найдено”. Норма при гепатите требует также отсутствия антител JgM. Это значит, что не обнаружено признаков заболевания в организме.
2. Указание концентрации рибонуклеиновой кислоты гепатита в крови. Это наиболее важный результат анализа, указывающий на то, насколько велика вирусная нагрузка. Количественный ВГС-анализ (ПЦР) позволяет ее определить с высокой точностью.
3. Генотипический анализ ПЦР (HCV) РНК указывает на то, какой именно формой гепатита страдает пациент. Если по каким-то причинам цифра не указана, это показывает, что ПЦР-анализ на гепатит нашел вид заболевания, который не известен на территории России. В этих случаях используются более редкие анализаторы, позволяющие определить конкретный тип. Время от времени можно увидеть также и подтип заболевания, обозначенный латинской буквой. Однако это не имеет большого значения для определения методики лечения и того, как долго должна продолжаться терапия. Поэтому в большинстве случаев специалисты не обращают на такие пометки особого внимания. Они могут иметь значение только в отдельных случаях, если речь идет о редком виде патологии.

В некоторых случаях может быть так, что качественный анализ указывает на отсутствие заболевания, в то время, как результаты иммуноферментного осмотра свидетельствуют о том, что в крови ещё содержатся следы антител против генотипа этой патологии. Такое расхождение в результатах может возникнуть после недавно перенесённого острого заболевания. Основным анализом, на который опираются специалисты, остается все же ПРЦ, иммуноферментный анализ используется только для первичной оценки ситуации.

Видео

Нужно ли сдавать количественный ПЦР перед началом лечения гепатита С?

расшифровка количественного и качественного анализа, норма

Диагностика гепатита включает целый комплекс анализов для определения наличия вируса в крови. Одним из способов обнаружения заболевания является такой метод исследования, как ПЦР на гепатит С. Что это такое, почему анализ ПЦР на гепатит так важен, как его проводят и расшифровывают?

Что это такое

Полимеразная цепная реакция, или ПЦР, используется для диагностики язвы желудка, колита, энтерита. Но главное ее преимущество заключается в том, что она помогает обнаружить в организме как сам вирус гепатита C, так и антитела к нему, которые обладают способностью не вызывать реакции иммунной системы из-за их способности к мутации.

Исследование и его суть заключаются в создании определенных условий, при которых происходит цепная реакция РНК гепатита. Если при их сопоставлении с нуклеотидной последовательностью вируса гепатита C выявляются совпадения, это свидетельствует о том, что в крови имеются вирусные частицы, а в печени происходят процессы распада. Если количество вируса ниже определенного уровня, выносится отрицательный диагноз, если выше – положительный.

Важно понимать, что в первом случае не исключается недавнее инфицирование или мощная противовирусная терапия, являющиеся факторами, снижающими концентрацию опасных частиц, и анализ ПЦР на гепатит не работает. Высокий же уровень содержания вируса в организме в большинстве случаев сигналит о том, что в печени вот-вот начнется инфекционный процесс. Не исключено, что заболевание находится в запущенном состоянии и понадобится серьезная терапия, вплоть до пересадки органа.

Существует два вида исследования крови методом ПЦР при гепатите: количественный анализ и качественный анализ.

Враг печени номер один

Количественный ПЦР, как упомянуто выше, определяет концентрацию РНК вируса гепатита. Кроме того, он способен дать информацию об интенсивности, с которой развивается патология, и эффективности назначенного лечения. Количественный анализ на гепатит C крайне важен, поскольку фиксирует резистентность к действию противовирусных препаратов и позволяет скорректировать терапию.

После того как больной пройдет курс лечения, ПЦР помогает определить дальнейший порядок назначений. В некоторых случаях выявляется необходимость дополнительных обследований. Например, если уровень АЛП повышен (но не более, чем в 2 раза в течение полугода), а расшифровка анализа указывает на вирусную нагрузку выше 105 МЕ/мл, пациенту назначается биопсия. Если количественный анализ на ПЦР выявляет сильное воспаление и фиброз, больному прописывают курс лечения противовирусными препаратами.

В ситуациях, когда большое количество вирусных частиц сочетается с высоким показателем АЛТ, пациенту незамедлительно должно быть назначено лечение без проведения дополнительных диагностическим мероприятий.

Качественно расшифровать показатели при количественном анализе крови на гепатит могут только квалифицированные и опытные специалисты, а современные технологии помогают сделать это при низкой концентрации вируса в крови.

Качественный анализ ПЦР направлен на определение и подтверждение фактического присутствия вируса в организме. Его проводят при обнаружении в крови антител к гепатиту. Именно качественный анализ на гепатит гарантирует точность результата на 100% и позволяет поставить диагноз на ранних стадиях заболевания, что дает возможность начать борьбу с гепатитом уже в течение первых недель после заражения и повышает шансы на полное выздоровление (в случае с заболеванием типа B).

Страдает не только печень, но и соседние органы

Преимущества ПЦР

При исследовании методом ПЦР и расшифровке анализа крови на гепатит можно также определить генотип возбудителя заболевания. Всего существует 6 генотипов вируса и большое количество субтипов, однако в нашем регионе распространение получили 1, 2 и 3 генотипы.

Другими преимуществами данного вида диагностики являются:

• высокая точность полученных показателей и низкая вероятность ошибки в них;
• высокий уровень чувствительности к вирусным частицам в крови;
• возможность выявления сразу нескольких возбудителей;
• диагностика болезнетворных внутриклеточных микроорганизмов, обладающих высокой антигенной изменчивостью;
• работа с расшифровкой анализа на гепатит позволяет обнаружить скрытые текущие инфекции.

Кому назначают

Анализ ПЦР на гепатит обязательно сдают следующие категории людей:

• беременные женщины;
• сотрудники учреждений здравоохранения;
• потенциальные доноры крови и органов;
• те, кто имеют характерные признаки заболевания;
• ВИЧ-инфицированные лица;
• наркозависимые;
• лица, ведущие беспорядочную половую жизнь.

Планируя ребенка, необходимо сделать анализ на гепатит

Как проводится анализ и требуется ли к нему подготовка

Забор крови для ПЦР-исследования производится из вены. Как правило, это происходит утром до того, как человек поел, поскольку после приема пищи должно пройти минимум 8 часов. В крайних случаях кровь могут взять на исследование днем или вечером, но временной зазор между анализом и приемом пищи должен составлять не менее 5 часов.

Человеческий фактор может количественно отразиться на результатах: их точность в некоторых случаях снижается со 100% до 95%, поэтому к сдаче крови необходимо заблаговременно готовиться. Качество биоматериала для анализа будет соответствующим при следовании пациентом следующим правилам:

• перед сдачей крови можно пить только чистую воду;
• за двое суток до проведения исследования нужно отказаться от приема жареной и жирной пищи, а также алкогольных напитков;
• за сутки до посещения лаборатории следует прекратить прием лекарственных средств. В случае если это не представляется возможным, об этом в обязательном порядке необходимо предупредить лаборанта и лечащего врача;
• накануне нужно избегать стрессовых ситуаций и физических нагрузок;
• не следует проходить ультразвуковое, рентгенологическое и инструментальное исследования незадолго до сдачи крови;
• в течение часа до анализа необходимо воздержаться от курения;
• за 20 минут до сдачи крови нужно отвлечься, успокоиться и выровнять дыхание.

Если исследование проходит ребенок до 5 лет, родители должны проследить, чтобы он пил кипяченую воду каждые 10 минут в течение получаса до забора биоматериала.

Расшифровка полученных данных

Расшифровка анализа может быть представлена словами (в случае качественного исследования), например, «не обнаружено» или «ниже диапазона изменений». В первом случае, это свидетельствует о том, что инфекция не обнаружена. Во втором – что вирус присутствует, но в незначительном количестве. Такая ситуация требует проведения повторного исследования.

Вирус типа С

Вирусная нагрузка определяется по количеству инфекционного РНК и обозначается как МЕ/мл или копии/мл.

Нормальным показателем (нормой) количественного анализа на гепатит C является диапазон от 1,8х102 до 2,4х107 МЕ/мл.

Концентрация вируса в крови может быть:

• низкой: от 600 МЕ/мл до 3х10⁴/мл;
• средней: от 3х10⁴ МЕ/мл до 8х10⁵ МЕ/мл;
• высокой: более 8х10⁵ МЕ/мл.

Количественны и качественны анализ ПЦР на гепатит позволяет определить наличие вируса в организме и уровень его концентрации. Полиразмерная цепная реакция способна диагностировать заболевание на ранних стадиях, но для этого необходимо, чтобы больные как можно раньше обращались в медицинские учреждения за помощь и строго следовали рекомендациям лечащего врача.

ПЦР гепатита С | Компетентно о здоровье на iLive

HCV в материале в норме отсутствует.

В отличие от серологических методов диагностики вирусного гепатита С, где обнаруживают антитела к HCV, ПЦР позволяет выявить наличие непосредственно РНК HCV и количественно выразить его концентрацию в исследуемом материале. Тест имеет видовую специфичность и высокую чувствительность: десяти молекул РНК HCV в исследуемом материале достаточно для его выявления. Обнаружение антител к HCV подтверждает лишь факт инфицирования пациента, но не позволяет судить об активности инфекционного процесса (о репликации вируса) и прогнозе заболевания. Кроме того, антитела к HCV обнаруживают как в крови больных острым и хроническим гепатитом, так и у тех пациентов, кто болел и выздоровел, а нередко антитела в крови появляются только через несколько месяцев после появления клинической картины заболевания, что затрудняет диагностику. Обнаружение HCV в крови с использованием ПЦР — более информативный метод диагностики. Выявление в ПЦР РНК HCV свидетельствует о виремии, позволяет судить о репликации вируса в организме и служит одним из критериев эффективности противовирусной терапии. Обнаружение РНК HCV с помощью ПЦР на ранних этапах развития вирусной инфекции на фоне полного отсутствия каких-либо серологических маркёров может служить самым ранним свидетельством инфицирования. Однако изолированное выявление РНК HCV на фоне полного отсутствия каких-либо других серологических маркёров не может полностью исключить ложноположительный результат ПЦР. В таких случаях необходима всесторонняя оценка клинических, биохимических и морфологических исследований с повторным неоднократным подтверждением наличия инфекции ПЦР.

Большое значение имеет применение метода ПЦР у больных с хроническим вирусным гепатитом С, так как у большинства из них отсутствует корреляция между наличием вирусной репликации и активностью печёночных ферментов. В таких случаях только ПЦР позволяет судить о наличии вирусной репликации, особенно если конечный результат выражают количественно. В большинстве случаев заболевания исчезновение из сыворотки крови РНК HCV происходит позже нормализации печёночных ферментов, поэтому их нормализация не может служить основанием для прекращения противовирусного лечения.

Практически важно для выявления РНК HCV исследовать методом ПЦР не только сыворотку крови, но и лимфоциты, гепатобиоптаты. Вирусы удаётся обнаружить в 2-3 раза чаще в ткани печени, чем в сыворотке крови. При оценке результатов исследования сыворотки крови на РНК HCV следует помнить, что виремия может носить флюктуирующий характер (как и изменение активности ферментов). Поэтому после положительных результатов исследования ПЦР можно получить отрицательный результат и наоборот. В таких случаях для разрешения возникающих сомнений лучше исследовать гепатобиоптаты.

Обнаружение РНК HCV в материале с помощью ПЦР используют в следующих целях:

• разрешение сомнительных результатов серологических исследований;
• дифференциация вирусного гепатита С от других форм гепатита;
• выявление острой стадии заболевания по сравнению с перенесённой инфекцией или контактом; определение стадии инфицированности новорождённых от серопозитивных по HCV матерей;
• контроль эффективности противовирусного лечения.

Пациенты с подозрением на вирусный гепатит С:

• доноры;
• лица с факторами риска;
• лица с повышенной активностью АЛТ;
• пациенты с острым гепатитом

Все вышеизложенные особенности оценки результатов и подходов к диагностике HCV с использованием ПЦР относятся и к другим инфекциям.

Метод ПЦР позволяет не только выявить РНК HCV в исследуемом материале, но и установить его генотип. Определение генотипа вируса имеет большое значение для подбора пациентов с хроническим вирусный гепатитом С к проведению лечения интерфероном-альфа и рибавирином. Лабораторные показания к лечению хронического вирусного гепатита С интерфероном альфа следующие:

• повышение активности трансаминаз;
• наличие РНК HCV в крови;
• генотип 1 HCV;
• высокая виремия в крови (более 8×10⁵ копий/мл).

В настоящее время можно количественно определять содержание РНК HCV в сыворотке крови методом ПЦР, что имеет большое значение для конроля за лечением интерфероном альфа. Уровень виремии оценивают следующим образом: при содержании РНК HCV от 10² до 10⁴ копий/мл — слабая; от 10⁵ до 10⁷ копий/мл — средняя, выше 10⁸ копий/мл — высокая. При эффективном лечении уровень виремии снижается.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]

Гепатит E: симптомы, лечение и профилактика

Что такое гепатит E?

Гепатит Е — потенциально серьезное острое заболевание. Это вызвано вирусом гепатита Е (HEV). Вирус поражает печень.

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ежегодно происходит 20 миллионов случаев инфицирования гепатитом Е, и 44 000 из этих случаев привели к смерти в 2015 году. Это чаще встречается в развивающихся странах. Гепатит Е обычно проходит сам, но может перерасти в острую печеночную недостаточность.

Если у человека появляются симптомы гепатита Е, они проявляются в течение нескольких недель после заражения. К ним относятся:

• пожелтение кожи (желтуха)
• темная моча
• боль в суставах
• потеря аппетита
• боль внизу живота
• увеличение печени
• острая печеночная недостаточность
• тошнота
• рвота
• усталость
• лихорадка

Большинство случаев гепатита Е вызвано употреблением питьевой воды, загрязненной фекалиями. Проживание в странах с плохими санитарными условиями или поездки в них могут увеличить ваш риск. Особенно это актуально в переполненных местах.

Реже гепатит Е может передаваться при употреблении в пищу продуктов от инфицированных животных. Он также может передаваться при переливании крови. Зараженная беременная женщина также может передать вирус своему плоду.

В большинстве случаев инфекция проходит сама по себе через несколько недель. В других случаях вирус вызывает печеночную недостаточность.

Чтобы диагностировать гепатит Е, ваш врач сделает анализ крови для поиска антител к вирусу.Диагностика может быть сложной задачей, потому что трудно различить разные формы гепатита.

В некоторых небольших исследованиях для людей с тяжелым острым заболеванием, не беременных, лечение рибавирином в течение 21 дня привело к улучшению функции печени.

Если есть подозрение на гепатит Е и ваша иммунная система не подавлена, вам могут не понадобиться лекарства. Врач может посоветовать вам отдохнуть, пить много жидкости, избегать алкоголя и соблюдать правила гигиены, пока инфекция не пройдет.

Беременные женщины, люди с подавленной иммунной системой или люди с острой печеночной недостаточностью, скорее всего, будут госпитализированы и находиться под наблюдением.

Гепатит Е обычно проходит самостоятельно с небольшими осложнениями. В редких случаях это может привести к острой печеночной недостаточности, которая может быть фатальной.

Показатели смертности от вируса низкие. Беременные женщины наиболее подвержены риску летальных осложнений. Люди с подавленной иммунной системой больше подвержены риску развития хронической версии гепатита E.

Чтобы избежать заражения гепатитом Е, будьте осторожны при употреблении антисанитарной воды.

В развивающихся странах пьют только очищенную или кипяченую воду. Избегайте сырых и неочищенных продуктов. К ним относятся фрукты, овощи и моллюски, которые обычно ополаскиваются водой.

Также важно соблюдать правила гигиены и часто мыть руки.

Гепатит С — AMBOSS

Последнее обновление: 9 октября 2020 г.

Резюме

Гепатит С — это инфекция, вызываемая вирусом гепатита С (ВГС), который поражает клетки печени и вызывает воспаление печени.Вирус в основном передается парентерально, особенно при внутривенном введении наркотиков или уколах иглой в медицинских учреждениях. У большинства пациентов в острой фазе симптомы отсутствуют, но может развиться лихорадка, недомогание, утомляемость или желтуха. Переход к хроническим инфекциям происходит в 85% случаев, поскольку бессимптомные пациенты редко диагностируются и лечатся. Хроническая инфекция связана с повышенной смертностью из-за цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы. При подозрении на инфекцию ВГС из-за контакта, клинических проявлений или повышенных уровней аминотрансферазы следует проводить тестирование на антитела ВГС и РНК ВГС для подтверждения диагноза.Острая инфекция ВГС лечится интерфероном-α, тогда как в случаях хронической инфекции рекомендуется комбинация двух противовирусных препаратов прямого действия (например, ледипасвира, софосбувира). Более 90% пациентов излечиваются при адекватном лечении.

Определение

• Острый гепатит С: инфекция ВГС, развивающаяся в течение первых 6 месяцев после заражения
• Хронический гепатит С: инфекция ВГС, которая сохраняется более 6 месяцев после заражения ^[1]

Эпидемиология

• Распространенность: до 2% населения США имеют хроническую инфекцию ВГС. ^[2]
• Заболеваемость: 1 случай на 100 000 населения,> 40 000 новых инфекций в год в США ^[3]
• Клиническое прогрессирование: у 75–85% лиц с инфекцией ВГС развивается хроническое заболевание ^[4]

Эпидемиологические данные относятся к США, если не указано иное.

Этиология

Возбудитель

Передача

Группы высокого риска по ВГС-инфекции

• Потребители наркотиков внутривенно (особенно длительное время) ^[9]
• Вирус гепатита B (HBV) или ВИЧ-инфицированные
• Заключенные
• Лица, родившиеся в период 1945–1965 годов ^[10]
• Получатели переливания крови или трансплантации органов до 1992 г.

Пациенты, история болезни которых указывает на высокий риск инфицирования ВГС, должны быть обследованы.

Клинические особенности

Острое течение

Симптомы неспецифичны и могут быть аналогичны симптомам других острых вирусных инфекций.

Хронический курс

• Это особенно заметно у бессимптомных лиц (до 85%), поскольку болезнь может не диагностироваться, а лечение может быть отложено или никогда не начато (состояние носительства). ^[1]
• Результаты часто легкие, неспецифические (например, усталость)
• Цирроз печени (до 25% случаев) в течение 20 лет после инфицирования ^[11]
• Внепеченочные особенности (общие)

Диагностика

• Обнаружение антител ^{[11] [12]}
  1. EIA / ELISA: стандартные иммуноферментные тесты на антитела к HCV; (положительный результат в случае острой, хронической или перенесенной инфекции ВГС)
  2. ПЦР на РНК HCV при положительных антителах.
     • Если ПЦР положительный: активная инфекция ВГС (может быть острой или хронической)

ПЦР и инфекционные заболевания | IntechOpen

1. Введение

Инфекционные заболевания (ИД) вызываются патогенными микроорганизмами, такими как бактерии, вирусы, паразиты или грибки, и эти заболевания могут прямо или косвенно передаваться от одного человека к другому. Научные достижения в области биомедицины с первой половины прошлого века, представленные разработкой терапевтических препаратов, вакцин и передовых технологий санитарии, были достигнуты в результате контроля или предотвращения инфекционных заболеваний.Эти болезни считаются на глобальном уровне одними из наиболее распространенных проблем общественного здравоохранения. Актуальность этих патологий подтверждается количеством охваченных лиц, отсутствием знаний об инфекционных агентах, их социально-экономическом воздействии, углублением молекулярных исследований, предполагающих точную и быструю диагностику, а также обращениями к исследованиям агентств общественного здравоохранения, направленным на развитие. диагностических методов для раннего выявления симптоматических носителей, а также бессимптомных носителей этих инфекций.

Изменения в обществе, технологиях и самих микроорганизмах способствуют возникновению новых болезней, повторному возникновению болезней, которые когда-то контролировались, и развитию устойчивости к противомикробным препаратам. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ID составляют значительную долю всех известных болезней человека, и по крайней мере 25% из примерно 60 миллионов случаев смерти, которые происходят во всем мире каждый год, по оценкам, вызваны инфекционными заболеваниями [1, 2] .

Научные исследования инфекционных агентов и болезней дают знания для разработки диагностических тестов для таких болезней, лекарств для лечения и вакцин для профилактики.Более ранняя точная и эффективная диагностика — одна из наиболее подходящих форм и стратегий лечения. По данным [3], в американских больницах ежегодно регистрируется около 5 миллионов случаев инфекционных заболеваний. Кроме того, о большинстве случаев не сообщается, что приводит к значительной заболеваемости и смертности [3]. В последние 20 лет методы анализа, основанные на обнаружении и секвенировании рДНК 16S, широко используются вместо традиционных методов культивирования.

К сожалению, несмотря на то, что в клинических лабораториях, диагностика инфекционных заболеваний напрямую связана со временем идентификации патогена с помощью традиционных методов культивирования, поскольку эти тесты требуют длительного времени обработки, от часов до дней.Техническая трудность, с которой столкнулись эти методы до появления молекулярных методов, заключалась в том, что не все патогены можно культивировать, и условия культивирования обычно неизвестны. К другим ограничениям традиционной диагностики относятся требования к дополнительному тестированию и времени ожидания для характеристики обнаруженных патогенов (т.е. различение видов, факторов вирулентности и устойчивости к противомикробным препаратам) [3, 4].

Амплификация нуклеиновых кислот является одним из наиболее ценных инструментов практически во всех областях науки о жизни, включая прикладные области, такие как клиническая медицина, для диагностики инфекционных заболеваний.

Серологические методы ограничены перекрестными реакциями между типами агентов и тем фактом, что некоторые инфекционные агенты не имеют четко идентифицированных эпитопов, которые были бы достаточно специфичными, что требует их в качестве строгой клинической диагностики. Кроме того, специфические антитела IgM выявляются только в острой фазе инфекции, а серологические тесты для выявления инфекций неточны, трудоемки и ненадежны. За последние 20 лет методы анализа, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, широко использовались во всех областях науки о жизни как новый способ диагностики патогенов человека, таких как вирусы, бактерии и паразиты.

Использование методов амплификации, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), давно используется для обнаружения, генотипирования и количественной оценки вирусов и бактерий в различных клинических образцах, таких как сыворотка, плазма, моча, сперма и жидкая спинномозговая жидкость ( CSF).

Диагностика на основе ПЦР была эффективно разработана для широкого круга микроорганизмов. Благодаря своей невероятной чувствительности, специфичности, воспроизводимости, широкому динамическому диапазону и скорости амплификации, специалисты по инфекционным заболеваниям отстаивают ПЦР для идентификации организмов, которые нельзя выращивать in vitro, или в случаях, когда существующие методы культивирования нечувствительны и / или необходимы. увеличенное время инкубации [5].

Успехи в развитии молекулярной технологии и диагностики позволили лучше понять этиологию, патогенез и молекулярную эпидемиологию ИД, что обеспечивает основу для соответствующих мер обнаружения, количественной оценки, профилактики и контроля, а также рационального дизайна вакцины, с помощью которой некоторые заболевания был успешно устранен.

С 1985 года для обнаружения и идентификации были разработаны многие методы, основанные на ПЦР-амплификации, включая: мультиплексную ПЦР (M-PCR), LAMP-PCR, цифровую PCR (dPCR) и ПЦР в реальном времени.

2. Методы ПЦР и клиническое применение в диагностике инфекционных заболеваний

2.1 Мультиплексная ПЦР

В диагностических лабораториях использование ПЦР часто ограничивается ее стоимостью, а иногда и наличием адекватного объема образца. Чтобы преодолеть эти проблемы, а также повысить диагностические возможности ПЦР, существует тип, называемый мультиплексной ПЦР (mPCR). MPCR относится к использованию различных пар праймеров для одновременной амплификации нескольких областей нуклеиновой кислоты образца с визуализацией амплифицированных продуктов с помощью гель-электрофореза.Использование нескольких пар праймеров в мПЦР — это инновация, которая дает значительные преимущества с точки зрения затрат, времени и точности диагностики. Основным преимуществом этой технологии является минимизация количества отдельных реакций, например, обнаружение нескольких патогенов одновременно в одном образце, таких как патогены, передающиеся половым путем [6, 7, 8]. Этот метод позволяет диагностировать несколько заболеваний с помощью одного диагностического теста, с чувствительностью, специфичностью и скоростью, незаменимыми значениями в диагностических тестах.

Этот метод стал основой исследований и клинических диагностических приложений, таких как инфекции, передаваемые половым путем (ИППП). Учитывая серьезную проблему общественного здравоохранения, ИППП повсеместно распространены в развитых и развивающихся странах. По оценкам, ежегодно возникает более 340 миллионов новых случаев бактериальных ИППП, включая гонорею, хламидиоз и сифилис, и заболеваемость во всем мире увеличивается среди взрослых в возрасте 15–49 лет [9]. Восприимчивость к инфекциям, передаваемым половым путем, включая вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), и высокая стоимость лечения привели к необходимости в быстрых и надежных лабораторных методах идентификации патогенов.Были разработаны процедуры амплификации нуклеиновых кислот для выявления патогенов, передающихся половым путем, особенно методы mPCR [10].

Мультиплексная ПЦР может анализировать множество образцов за одну реакцию и полезна для диагностики мультипатогенных инфекций. Однако у него есть некоторые ограничения, такие как неспецифические продукты, образующиеся в результате взаимодействий праймер-праймер, которые могут мешать амплификации мишеней, снижению чувствительности и селективности реакций.

2.2 Петл-опосредованная изотермическая амплификация

Амплификация нуклеиновых кислот обычно используется в области биологических исследований. С развитием молекулярной биологии впоследствии было разработано много новых технологий молекулярной диагностики [11].

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP-ПЦР) была впервые разработана более 15 лет назад и стала мощным методом одновременного обнаружения нескольких патогенов [12, 13]. В этом методе используется ДНК-полимераза с активностью замещения цепи и набор из четырех внутренних и внешних праймеров, которые распознают в общей сложности шесть различных последовательностей целевой ДНК.Кроме того, способ включает два последовательных этапа амплификации, первый этап включает mPCR, а второй этап — LAMP. Ампликоны первого шага служат шаблонами для второго шага. Протокол амплификации требует только одной температуры для реакции, и амплификация диагностируется без необходимости в электрофоретических методах, используя процесс обнаружения in situ с помощью колориметрического красителя или флуоресцентного красителя. Конечным продуктом является накопление 10 ⁹ копий целевой ДНК менее чем за час.LAMP-ПЦР считается инновационной технологией и возникла как альтернатива методологиям на основе ПЦР в клинических лабораториях со значительным увеличением пределов обнаружения, эффективности, селективности и специфичности по сравнению с одноэтапной.

Поскольку все больше и больше ученых сосредотачивают свое внимание на применении технологии LAMP, диапазон ее использования больше не ограничивается обнаружением и идентификацией бактерий [14]. LAMP-PCR была разработана и использована для обнаружения видов, вызывающих хориоамнионит и преждевременные роды, Ureaplasma parvum и Ureaplasma urealyticum [15].

Применялся также для обнаружения паразитов и вирусов [16, 17, 18]. Недавно Куросаки и др. в своем исследовании [19] в 2017 году разработали анализ LAMP-PCR для обнаружения образцов плазмы, сыворотки и мочи вируса Зика, взятых у 120 предполагаемых случаев арбовирусной инфекции в Бразилии.

2.3 ПЦР в реальном времени

Согласно [20], клинические диагностические подходы основаны на количественной ПЦР (кПЦР) как на методе обнаружения и количественной оценки инфекционных агентов. Методы, основанные на флуоресцентной химии, произвели революцию в молекулярной диагностике и стали золотым стандартом для количественной оценки вирусной нагрузки и обнаружения бактериальных и вирусных патогенов.Во время кПЦР нуклеиновая кислота амплифицируется до тех пор, пока не будет получен сигнал определенного уровня, который передается через интеркалирующий краситель ДНК или специфичный для последовательности флуоресцентный зонд. Порог цикла (Cq), определяемый как количество циклов амплификации, необходимых для достижения этого уровня сигнала, используется для расчета количества изначально присутствующих молекул-мишеней на основе стандартной кривой [20]. В кПЦР мишени обнаруживаются в реальном времени с запечатанного планшета для ПЦР, и пост-ПЦР обработки не требуется; Таким образом, риск получения ложноположительных результатов из-за переноса ампликона существенно снижается по сравнению с обычным методом [21].

За последнее десятилетие преимущества ПЦР стали золотым стандартом в диагностике инфекционных заболеваний, особенно вирусных заболеваний, таких как арбовирусы. Арбовирусы вызывают беспрецедентную беду для здоровья в мире, особенно в странах Латинской Америки, с ежедневным ростом статистики. Диагноз этих заболеваний сложно установить только по клиническим особенностям. Значительная часть этих инфекций протекает бессимптомно, но у некоторых пациентов могут также проявляться клинические симптомы, сходные с симптомами арбовирусов, например, вызванных вирусами денге, зика и чикунгунья.Метод КПЦР более чувствителен и специфичен, чем серологические тесты. Кроме того, по образцам сыворотки можно провести диагностику только в острой фазе заболевания, которая длится до 4–7 дней после появления симптомов. В отношении обнаружения вируса Зика (ZIKV), например, недавние литературные данные показывают, что в моче человека вирусная РНК обнаруживается дольше, чем в сыворотке, до 20 дней после появления первых симптомов. Исследования показывают, что в сперме генетический материал ZIKV был обнаружен в течение недель и даже месяцев после заражения [22].Однако определение вирусной нагрузки представляет некоторые особые проблемы при использовании методологии qPCR. Это связано с тем, что надежные результаты абсолютной концентрации qPCR зависят от эффективности анализа, показателей калибровки прибора и сравнения с известным эталонным образцом для преобразования измерений Cq в неизвестный образец.

2.4 Цифровая ПЦР

В отличие от кПЦР цифровая ПЦР (dPCR) использует альтернативный метод, который не зависит от определения цикла амплификации, когда сигнал репортерного красителя превышает пороговое значение.Вместо этого перед амплификацией образцы, которые должны быть подвергнуты цПЦР, разделяются на тысячи независимых реакций ПЦР и оцениваются как положительные или отрицательные для амплификации интересующей вирусной последовательности. Положительные лунки подсчитываются и преобразуются в целевую концентрацию в исходном образце. Такое бинарное распределение каждой реакции значительно сводит к минимуму зависимость измерения от таких параметров, как эффективность анализа и калибровка прибора. Следовательно, цПЦР — это метод абсолютного количественного определения с наибольшим потенциалом для количественного определения вирусных нуклеиновых кислот с низкой нагрузкой.

В диагностической программе очень часто получают положительные результаты КПЦР, полученные на пределе обнаружения этой методологии, что может привести к неопределенности результата. ЦПЦР — это дополнительная методология, которая работает вне пределов обнаружения количественной ПЦР, так как она основана на распределении Пуассона. Следовательно, эта методология оказывает значительное влияние на исследования, а также на диагностические приложения [23, 24, 25].

Можно указать некоторые преимущества цифровой ПЦР в вирусологии [25]:

• Количественное определение вирусных геномов в образцах без использования стандартной кривой;

• Обнаружение вирусов с очень низкой вирусной нагрузкой;

• Использование проб низкой концентрации;

• Снижение воздействия ингибиторов, присутствующих на сложных образцах.

В таблице 1 показано сравнение двух методологий: qPCR и dPCR.

количественное без стандартной кривой

Таблица 1.

Сравнительный анализ RT-qPCR и dPCR.

В большом количестве исследований цПЦР используется для диагностики вирусов, связанных с инфекционными заболеваниями, включая вирус гепатита В (HBV), цитомегаловирус, человеческий грипп и ВИЧ [26, 27, 28]; бактериальные инфекции ( Mycobacterium tuberculosis , Chlamydia trachomatis и Staphylococcus aureus ) [29, 30, 31]; и паразитарные инфекционные, такие как обнаружение Plasmodium falciparum и Plasmodium vivax [32].

3. Выводы

Возможность одновременного обнаружения нескольких патогенов, заражающих хозяина, имеет решающее значение для точной диагностики инфекционных заболеваний, выявления коинфекций и оценки болезненного состояния для эффективного ведения пациентов. Технология ПЦР широко используется для обнаружения и количественного определения патогенных микроорганизмов, вызывающих различные инфекционные заболевания, включая некоторые арбовирусы, ИППП и бактериальные инфекции. Эта методология революционизирует область молекулярной диагностики из-за ее высокой чувствительности обнаружения и специфичности для определения инфекционных агентов.Кроме того, по сравнению с традиционными методами культивирования, например, для определения количества конкретного патогена в клиническом образце, сокращается время выполнения и стоимость. Основными преимуществами ПЦР являются ее более высокая чувствительность и специфичность по сравнению с другими диагностическими методами, такими как серологические анализы и методы культивирования, а также ее быстрота, полезность и универсальность в клинической лаборатории.

Хотя обычная ПЦР является наиболее широко используемым молекулярным методом, были разработаны и другие методики, включая ПЦР в реальном времени, мультиплексную ПЦР, LAMP-PCR и цифровую ПЦР.Биохимические механизмы этих методов основаны на ферментно-опосредованных процессах, амплификации мишени, сигнала или зонда и изотермических условиях.

Учитывая клиническую важность этих заболеваний, количество инфицированных людей во всем мире и серьезные последствия для здоровья населения чрезвычайно важны для точной, быстрой и чувствительной диагностики этих заболеваний в лабораториях. Несмотря на это, по-прежнему существует потребность в достижениях в фундаментальных научных исследованиях и разработке молекулярных технологий, которые обеспечивают основу для точной диагностики и молекулярной эпидемиологии инфекционных заболеваний, а также мер контроля, профилактики и разработки вакцин и мониторинга инфекций. лицом к лицу лечение, применяемое в клинической практике.

% PDF-1. 7
%
105 0 объект
>
endobj

xref
105 79
0000000016 00000 н.
0000002568 00000 н.
0000002768 00000 н.
0000002820 00000 н.
0000002854 00000 н.
0000002890 00000 н.
0000003418 00000 н.
0000003541 00000 н.
0000004195 00000 н.
0000004646 00000 п.
0000005185 00000 н.
0000005700 00000 н.
0000005808 00000 п.
0000005918 00000 н.
0000006512 00000 н.
0000006596 00000 н.
0000007229 00000 н.
0000007893 00000 н.
0000007986 00000 п.
0000008367 00000 н.
0000008861 00000 н.
0000010454 00000 п.
0000011083 00000 п.
0000011647 00000 п.
0000012279 00000 п.
0000012377 00000 п.
0000014060 00000 п.
0000015702 00000 п.
0000016379 00000 п.
0000017057 00000 п.
0000017768 00000 п.
0000017895 00000 п.
0000019309 00000 п.
0000020656 00000 п.
0000022112 00000 п.
0000023859 00000 п.
0000025560 00000 п.
0000029816 00000 п.
0000034882 00000 п.
0000037997 00000 п.
0000044021 00000 п.
0000049275 00000 п.
0000049619 00000 п.
0000049920 00000 н.
0000049955 00000 н.
0000050001 00000 п.