Сколько пить арбидол: Арбидол инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание Arbidol капс. 100 мг: 5, 10, 20 или 40 шт. (3331)

Ученые оценили эффективность «Арбидола» при лечении COVID-19

Китайские ученые пришли к выводу, что противовирусный препарат «Арбидол», а также комбинация лекарств лопинавира и ритонавира не являются эффективными средствами для лечения пациентов с коронавирусом.

Ученые провели исследование действия препаратов после того, как они попали в список потенциальных средств от COVID-19, составленный Национальной комиссией по здравоохранению Китая. В эксперименте приняли участие 86 пациентов с легкой и средней формами заболевания.

Отмечается, что 34 пациента принимали комбинацию лопинавир/ритонавир, 35 получали «Арбидол», еще 17 заболевших не принимали какую-либо терапию. При этом динамика течения болезни у всех инфицированных была практически одинаковой, в том числе по уровню снижения температуры, смягчению кашля или улучшению результатов КТ грудной клетки.

В конце февраля Федеральная антимонопольная служба начала расследование по делу о рекламе «Арбидола» как средства от коронавируса. Из рекламы, распространявшейся в эфире радиостанций, следовало, что «Арбидол» обладает терапевтической эффективностью против коронавируса COVID-2019. При этом, по данным ФАС, специфических лекарств для лечения коронавируса не существует.

10 марта по результатам рассмотрения дела ФАС сообщила, что реклама «Арбидола», который был заявлен производителем как средство для лечения пневмонии COVID-19, выходит за пределы инструкции препарата, пишут «Известия».

Ранее Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала не принимать ибупрофен при лечении от коронавируса. Для этих целей специалисты советуют пить парацетамол. Об заявил пресс-секретарь организации Кристиан Линдмайер.

— Не было опубликовано новых свидетельств того, что ибупрофен повышает риск смертности. Недостаточно исследований, и эксперты пока изучают данные. Пока же мы рекомендуем предпочесть парацетамол и не использовать ибупрофен в качестве самолечения, — отметил Кристиан Линдмайер.

По его словам, ибупрофен можно принимать по назначению врача, если препарат необходим по медицинским показателям.

В Краснодарском крае на 23 апреля подтверждено 58 новых случаев заражения коронавирусной инфекцией.

Оперативный штаб Краснодарского края сообщает, что среди заболевших 32 женщины и 26 мужчин, в том числе пять несовершеннолетних в возрасте от 5 до 17 лет.

Всего на сегодня в регионе 539 пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19.

Причиной роста числа зараженных коронавирусом в России стал тот факт, что жители страны не сразу начали соблюдать режим самоизоляции. Такое мнение высказала главный внештатный специалист по инфекционным заболеваниям Минздрава РФ Елена Малинникова.

Краснодарский край вошел в топ-3 регионов по эффективности борьбы с COVID-19.

Почему покупать «Арбидол» для защиты от коронавируса — не самая лучшая идея

https://www.znak.com/2020-02-21/pochemu_pokupat_arbidol_dlya_zachity_ot_koronavirusa_ne_samaya_luchshaya_ideya

2020.02.21

Национальная комиссия Министерства здравоохранения КНР выпустила шестую версию рекомендаций по лечению коронавирусной пневмонии, согласно которым в качестве противовирусного средства было предложено три раза в день принимать по 200 мг препарата «Абидол». Скорее всего, «Абидол» — дженерик российского препарата «Арбидол», который не имеет доказанной эффективности даже при лечении обычного гриппа. 

Jiang Kehong / Xinhua / Global Look Press

Что такое «Арбидол»?

Международное непатентованное наименование «Арбидола» — умифеновир (этиловый эфир метилфенилтиометил-диметиламинометил-гидроксиброминдол карбоновой кислоты). Этот препарат относится к фармакологической группе «иммуномодуляторы» — то есть предназначен для «стимуляции иммунных процессов и активации иммунокомпетентных клеток».  

Согласно заявлению производителя, препарат был в разработан в 1974 году учеными Всесоюзного научно-исследовательского химико-фармацевтического института (ВНИХФИ). От разработки молекулы до регистрации препарата прошло 14 лет. «За этот период в ходе множества экспериментов были получены исчерпывающие сведения о механизме действия препарата, о его высокой безопасности и эффективности в ходе ряда успешных экспериментов на животных и при изучении клинического действия препарата».

Однако Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) признала клинические испытания препарата Аrbidol, проведенные с 1993 по 2004 год, недостаточно качественными, чтобы соответствовать требованиям доказательной медицины.

Международное медицинское сообщество эффективность умифеновира и «Арбидола» не проверяло. В Кокрановском регистре контролируемых испытаний есть ссылки исключительно на исследования российских ученых. Неудивительно, что в рекомендациях ВОЗ по лечению гриппа «Арбидол» отсутствует.

Почему же тогда Китай включил «Арбидол» в клинические рекомендации?

В одной из научных работ было показано, что умифеновир способен связываться с вирусами гриппа, мешая им проникать в клетки. Хотя эффект был получен только в пробирке, а не на живых людях, этот факт позволяет считать препарат «потенциально эффективным» при респираторных вирусных инфекциях. 

Согласно разработанному ВОЗ «Руководству по решению этических проблем, связанных с инфекционными заболеваниями», если во время эпидемии нет лекарств с доказанной эффективностью, допустимо включать в национальные рекомендации потенциально эффективные средства. Однако это не означает автоматического международного признания эффективности «Арбидола» в качестве «антикоронавирусного» препарата. 

Включение в рекомендации — своеобразный «аванс» препарату, который еще должен будет доказать свою эффективность в строгих клинических испытаниях, качество которых будет признано международным медицинским сообществом. А пока их нет, утверждать, что «Арбидол» помогает от коронавируса, нельзя.

Хочешь, чтобы в стране были независимые СМИ? Поддержи Znak.com

Арбидол, 100 мг, капсулы, противовирусное от гриппа и ОРВИ, 40 шт.

Цены в аптеках на Арбидол

100 мг, капсулы, противовирусное от гриппа и ОРВИ, 40 шт.

Аптека.ру

951₽

Купить

ЗдравCити

1032₽

Купить

Планета Здоровья

940₽

Купить

Будь здоров!

от 886₽

Купить

Ригла

от 886₽

Купить

АСНА

от 943₽

Купить

Живика

886₽

Купить

Доктор Столетов

от 1114₽

Купить

Самсон-Фарма

1114₽

Купить

Диалог

от 950₽

Купить

ПроАптека

от 981₽

Купить

Мосаптека

1114₽

Купить

Надежда Фарм

930₽

Купить

Алоэ

1012₽

Купить

Аптека Апрель

от 952₽

Купить

Аптечество

от 1003₽

Купить

Супераптека

1114₽

Купить

Здесь Аптека

1093₽

Купить

Хорошая Аптека

1114₽

Купить

Озерки

1114₽

Купить

Первая помощь

1114₽

Купить

WER.RU

1005₽

Купить

Еврофарм

1102₽

Купить

Максавит

1104₽

Купить

История стоимости Арбидол

100 мг, капсулы, противовирусное от гриппа и ОРВИ, 40 шт.

01.03-07.03
1076₽ (+15₽)

08.03-14.03
1027₽ (-49₽)

15.03-21.03
1001₽ (-26₽)

22.03-28.03
958₽ (-43₽)

Указана средняя стоимость товара в аптеках Москвы за период и разница по сравнению с предыдущим периодом

Инструкция на Арбидол

100 мг, капсулы, противовирусное от гриппа и ОРВИ, 40 шт.

Состав

Действующее вещество: умифеновира гидрохлорида моногидрат (в пересчете на умифеновира гидрохлорид) – 100 мг.

Вспомогательные вещества: крахмал картофельный – 30,14 мг, целлюлоза микрокри-сталлическая – 55,76 мг, кремния диоксид коллоидный (аэросил) – 2,0 мг, повидон К 25 (коллидон 25) – 10,1 мг, кальция стеарат – 2,0 мг.

Капсулы твердые желатиновые № 1:
Корпус: титана диоксид (Е 171) – 2,0000 %, желатин – до 100 %.

Крышечка: титана диоксид (Е 171) – 1,3333 %, краситель солнечный закат желтый (Е 110) – 0,0044 %, хинолиновый желтый (Е 104) – 0,9197 %, желатин – до 100 %.

Фармакокинетика

Быстро абсорбируется и распределяется по органам и тканям. Максимальная концентрация в плазме крови достигается через 1,5 ч. Метаболизируется в печени. Период полувыведения равен 17-21 ч.

Около 40 % выводится в не измененном виде, в основном с желчью (38,9 %) и в незначительном количестве почками (0,12 %). В течение первых суток выводится 90 % от введенной дозы.

Арбидол: Противопоказания

Повышенная чувствительность к умифеновиру или любому компоненту препарата; дет-ский возраст до 6 лет. Первый триместр беременности. Период грудного вскармливания

Арбидол: Побочные действия

Препарат Арбидол® относится к малотоксичным препаратам и обычно хорошо переносится.

Побочные эффекты возникают редко, обычно слабо или умеренно выражены и носят преходящий характер.

Частота возникновения нежелательных лекарственных реакций определена в соответствии с классификацией ВОЗ: очень часто (с частотой более 1/10), часто (с частотой не менее 1/100, но менее 1/10), нечасто (с частотой не менее 1/1000, но менее 1/100), редко (с частотой не менее 1/10000, но менее 1/1000), очень редко (с частотой менее 1/10000), частота неизвестна (не может быть установлена по имеющимся данным).
Нарушения со стороны иммунной системы: редко – аллергические реакции.

Если любые из указанных в инструкции побочных эффектов усугубляются, или Вы заметили любые другие побочные эффекты, не указанные в инструкции, сообщите об этом врачу.

Передозировка

Взаимодействие

При назначении с другими лекарственными средствами отрицательных эффектов отмечено не было.
Специальные клинические исследования, посвященные изучению взаимодействий препарата Арбидол® с другими лекарственными средствами, не проводились.

Сведения о наличии нежелательного взаимодействия с жаропонижающими, муколитическими и местными сосудосуживающими лекарственными средствами в условиях клинического исследования не были выявлены.

Особые указания

Необходимо соблюдать рекомендованную в инструкции схему и длительность приема препарата. В случае пропуска приема одной дозы препарата, пропущенную дозу следует принять как можно раньше и продолжить курс приема препарата по начатой схеме.
Если после применения препарата Арбидол® в течение трех суток при лечении гриппа и других ОРВИ сохраняется выраженность симптомов заболевания, в том числе высокая температура (38 °С и более), то необходимо обратиться к врачу для оценки обоснованно-сти приема препарата.

Форма выпуска

Капсулы, 100 мг.
По 5 или 10 капсул в контурную ячейковую упаковку. 1, 2 или 4 контурные упаковки с инструкцией по применению в пачку из картона.

Производитель

ОАО “Фармстандарт-Лексредства”

Основные сведения

Торговое название

Арбидол

Действующее вещество (МНН)

Умифеновир

Дозировка или размер

100 мг

Форма выпуска

капсулы

Форма выпуска (доп.инфо.)

противовирусное от гриппа и ОРВИ

Первичная упаковка

упаковка контурная ячейковая

Количество в упаковке

40

Производитель

Фармстандарт

Страна

Россия

Срок годности

3 года

Условия хранения

При температуре не выше 25 °C

Сертификаты Арбидол

100 мг, капсулы, противовирусное от гриппа и ОРВИ, 40 шт.

Увеличить

Увеличить

Арбидол вошел в Программу диагностики и лечения COVID-19

В начале мая журнал Current Medical Science опубликовал результаты исследования по пост-контактной профилактике коронавируса – возбудителя COVID-19. Ученые из КНР выяснили, какой препарат может предотвратить передачу заболевания после контакта с инфицированным человеком. Подробности – в сюжете Марины Кулагиной.

Новый вирус, являющийся причиной болезни COVID-19, сочетает в себе геномы разных по свойствам других коронавирусов и особенности структуры поверхностных белков, позволяющих более эффективно проникать в клетки. Поэтому он быстро распространяется между людьми. При этом риск заражения и тяжесть болезни напрямую зависят от продолжительности контакта с инфицированным человеком и количества вирусных частиц, попавших в организм человека.

Контакты людей в помещении – главный способ распространения COVID-19. При этом большинство случаев передачи вируса происходит при общении в стенах дома. Так, если один человек «подцепил» коронавирус, то, пока у него не проявились симптомы, он может заразить своих родственников.

Медицинские работники и члены семей заболевших – две группы, входящие в зону максимального риска заражения.

Критически важной в этих группах становится медикаментозная профилактика.

Группа китайских ученых из Университета науки и техники города Ухань обратила внимание на умифеновир – препарат с широким спектром противовирусной активности, известный в России под торговой маркой «Арбидол». В комбинации с другими препаратами он применялся в Китае с начала эпидемии и вошел в Программу диагностики и лечения COVID-19.

Исследование in vitro, в котором приняли участие 27 семей и 124 медработника, показало, что Арбидол эффективно ингибирует заражение коронавирусом, блокируя его проникновение в клетку.

Показатель защищенности составил 98,2% среди членов семей, в которых есть зараженный человек, и 81% среди медицинских работников. На основании полученных результатов ученые сделали вывод об эффективности Арбидола в качестве средства постконтактной профилактики. Авторы исследования отмечают, что опыт его применения может быть расширен и стать объектом дальнейшего изучения.

Препарат имеет высокий профиль безопасности и отпускается без рецепта.

Чем нас лечат: Ингавирин. Одно действующее вещество на два препарата

Вирусология и ее вопросы

Другая статья из того же списка публикаций на сайте была опубликована в журнале «Российская стоматология» с импакт-фактором 0,139. Такой низкий показатель можно объяснить тем, что стоматология — довольно узкая область, где цитируемость по определению не может быть высокой. Но рядом с названием журнала даже не стоит пометка «рецензируемый». Если журнал узкоспециальный, это еще не значит, что статьи не должны перед публикацией проходить отбор, который производят не издатели, а коллегия экспертов-профессионалов. Похожая ситуация и с журналом «Терапевтический архив», импакт-фактор которого, однако, намного выше и составляет целых 0,693 цитирования на статью.

У журнала «Вопросы вирусологии», где была также опубликована одна из статей, размещенных на сайте препарата, импакт-фактор составляет 0,415. Хотя журнал и является рецензируемым, в нем же была опубликована и статья о неэффективности Ингавирина в нетоксичных для клеток концентрациях (по крайней мере, так сообщается в ряде источников, полного текста самой статьи «Львов Д.К., Бурцева Е.И., Прилипов А.Г. и др. «Изоляция 24.05.2009 и депонирование в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ №2452 от 24.05.2009) первого штамма А/IIV-Moscow/01/2009(h2N1)swl, подобного свиному вирусу А(h2N1) от первого выявленного 21.05.2009 больного в Москве», Вопросы вирусологии, 2009, №5, стр.10-14» найти не удалось, а в абстракте статьи Ингавирин не упомянут вовсе).

Пожалуй, один из самых высокоимпактных журналов, в котором была опубликована статья про Ингавирин, стал Pharmaceuticals (Basel). Сейчас его импакт-фактор составляет 5,30 — вполне приемлемый для медицинского журнала уровень, однако на момент публикации статьи (2011 год) этот показатель был равен всего 1,42.

«Из чего же, из чего же?», или «Двое из ларца»

Действующее вещество препарата обозначено как 2-(имидазол-4-ил)-этанамид пентандиовой-1,5 кислоты. На какой белок-мишень вируса действует эта молекула, непонятно. Многочисленные статьи ответа на этот вопрос не дают.

Интересно отметить, что одно и то же вещество в одинаковой форме изначально позиционировалось производителями — компанией «Валента Фарм» — как два разных препарата, Дикарбамин и Ингавирин. Стоит отметить, что Дикарбамин изначально проходил испытания в качестве средства от рака. Вскоре после выпуска этих средств в продажу было признано незаконным согласно ФЗ от 12 апреля 2010 г. N 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств». Сравнение описаний Дикарбамина и Ингавирина тоже приводит к любопытным результатам. Одно и то же вещество в зависимости от упаковки начинает вести себя по-разному, например то «доступными способами в крови не определяется», то, напротив, «определяется через 10 минут в плазме крови», защищает то от вирусных заболеваний, то от последствий химиотерапии (причем оба препарата относятся к группе противовирусных и противовоспалительных средств). Лицензия Дикарбамина была отозвана в 2013 году.

94 отзыва, инструкция по применению

как лечить коронавирус — Новости — Агентство ТВ-2 — актуальные новости в Томске сегодня

Лечение коронавируса похоже на лечение ОРВИ: нужно принимать противовирусные препараты и пить много жидкости, рассказал замгубернатора Иван Деев в рамках прямого эфира в Инстаграме. 

По словам Деева, если человек почувствовал недомогание, то должен начать прием витаминов D, С, Е, селена, цинка.

«Вирус начинает развиваться в носу. Поэтому нельзя допускать вокруг себя присутствие людей с открытым носом. В этой связи используются противовирусные препараты — интерфероны, причем любые. Это может быть «Гриппферон», интерферон альфа и так далее. Далее идет группа препаратов, которые люди пьют, это противовирусные, это разные совершенно препараты: и «Арбидол», тот же самый «Ингавирин», «Триазавирин», «Изопринозин», «Коронавир», «Авифавир», «Арепливир» — много разных. Не нужно останавливаться на каком-то одном противовирусном препарате», — сказал Иван Деев.

Для успешного лечения необходимо выпивать до трех литров жидкости в день. Желательно щелочной. Иван Деев отметил, что лучше всего подойдут «Карачинская» или «Омега».

Для лечения кашля нужно принимать препараты, разжижающую мокроту. Например, АЦЦ. Однако, так как эти препараты вызывают откашливание, на ночь их лучше не пить. Если у человека высокая температура, то необходимо принимать жаропонижающие.

Антибиотики назначаются не с первого дня, уточнил Иван Деев. По его словам, их необходимо пить, если высокая температура держится больше трех дней. При этом антибиотики прописывают для предотвращения развития бактериальной пневмонии, а сам коронавирус они не лечат.

Он добавил, что телефон горячей линии для больных коронавирусом в Томской области: +7 (3822) 777-200. Обращаться на нее могут пациенты, у которых положительный тест на коронавирус. Если врача у COVID-положительного пациента еще не было, операторы горячей линии вызовут скорую или направят на дом специалиста из поликлиники.

В настоящее время в Томской области коронавирусом болеет больше 3100 человек. В Томской области 44,3 % свободного коечного фонда. Иван Деев отметил, что до перепрофилирования роддома № 4 в ковид-госпиталь в Томске было 12 % свободных коек. 

В России нет четкого протокола лечения коронавируса.  В России есть целых три лекарства от коронавируса: «Коронавир», «Авифавир» и «Арепливир», однако ряд независимых экспертов сомневаются в их эффективности.

«Легко заметить, что фуфломицины в России не выпускают от рака, гепатита С или туберкулеза. Их выпускают от простуд и гриппов, т.е. от болезней, которые носят массовый характер и от которых абсолютное большинство людей выздоравливает самостоятельно. Для того чтобы впаривать фуфломицин, нужна статистически значимая группа людей, которая его примет и скажет: «Ой, а я назавтра поправился», — писала Юлия Латынина в материале в «Новой газете».

Изначально ряд врачей говорили об эффективности противомалярийных препаратов. Однако независимыми исследованиями их эффективность также не доказана. 

Добавим, что рекламу «Арбидола» в качестве лекарства от COVID-19 признала незаконной Федеральная антимонопольная служба, он не зарегистрирован в США и отсутствует в рекомендациях ВОЗ по лечению гриппа. 

Арбидол и другие низкомолекулярные препараты, ингибирующие вирусы Ласса и Эбола

Препараты, блокирующие LASV и EBOV GP-опосредованное проникновение с аналогичной эффективностью. Мы начали это исследование со сравнения способности восьми препаратов ингибировать LASV и EBOV GP- опосредованная инфекция. Все восемь доступны перорально, устойчивые при комнатной температуре небольшие молекулы, которые блокируют вход EBOV (18–20, 22, 23, 40, 50) и процессы входа в цель, также используемые LASV (20–23, 51–53). Шесть одобрены для клинического использования, а два проходят расширенные клинические испытания.Эти коллективные особенности предлагают практические преимущества (например, чистые затраты и простоту транспортировки и доставки) по сравнению с новыми лекарствами, многие из которых разработаны по принципу «одно лекарство — одно средство» (54).

Пять препаратов продемонстрировали схожую эффективность против LASV и EBOV GP-опосредованного входа (таблица 1). Зонипорид, ингибитор обменника Na ⁺ / H ⁺ в плазматической мембране, блокирует заражение аренавирусом LCMV, препятствуя макропиноцитотическому захвату вирусных частиц (52). Поскольку и LASV (30), и EBOV (55, 56) попадают в клетки посредством макропиноцитоза, мы ожидали и обнаружили, что зонипорид имеет сходную активность против обоих.Два препарата, которые ухудшают закисление эндосом, необходимые для проникновения обоих вирусов (25, 49) — амодиахин (противомалярийный) и никлозамид (противоглистный) — также показали схожую эффективность против этих двух вирусных терапевтов в наших прямых сравнительных тестах. Оба, хотя и не в прямых сравнительных исследованиях, показали, что они подавляют многие патогены, проникающие в клетки путем эндоцитоза (21–23, 57–60). Четвертым препаратом с аналогичной активностью против обоих вирусов является апилимод, который ингибирует PIKfyve, фермент, необходимый для позднего созревания эндосом (51, 53, 61) и проникновения EBOV (27).Apilimod блокирует транспортировку EBOV в поздние эндосомы (51, 53), которые служат порталами как для EBOV, так и для LASV (25, 26, 62–64). Пятым препаратом с аналогичной эффективностью против LASV GP- и EBOV GP-опосредованного входа является арбидол (Умифеновир), синтетический противовирусный препарат, одобренный и используемый в России и Китае для борьбы с гриппом и обладающий противовирусной активностью широкого спектра действия (33, 34, 36). , 38, 39).

Три других препарата — кломифен, торемифен и сертралин — показали в ~ 3-6 раз большую активность против EBOV GP-, чем LASV GP-опосредованное проникновение. Это ИБС, которые блокируют инфекции EBOV (19, 20, 22, 23, 40) и вызывают накопление холестерина в поздних эндосомах, имитируя эффекты дисфункционального NPC1, рецептора EBOV (27, 28, 65). Поскольку LASV также проникает в клетки через поздние эндосомы (31), CADs могут мешать проникновению LASV из-за общих нарушений функции поздних эндосом. Повышенная активность торемифена и сертралина против EBOV (таблица 1) может быть связана с тем, что они могут связываться как с EBOV GP, как показывают анализы термостабильности и рентгеновской кристаллографии (66, 67), так и с вирусной и / или эндосомной мембраной ( 35, 39, 45, 66).

Механизмы, с помощью которых арбидол может блокировать проникновение LASV и инфицирование. Арбидол продемонстрировал примерно эквивалентную эффективность против LASV и EBOV GP-опосредованной псевдовирусной инфекции (рис. 1 и таблица 1), блокировал заражение аутентичным LASV (рис. 3) и был в некоторой степени неэффективным. более эффективен при блокировании LASV GP- по сравнению с HA-опосредованным слиянием и проникновением вируса гриппа (фиг. 2B и фиг. 4B). Было предложено три механизма действия арбидола против гриппа: прямое связывание с HA ( K _d [константа диссоциации], 47 мкМ для связывания с HA вируса гриппа PR8) (38, 44) и, как было предложено, для других вирусы, связывающиеся с вирусной и / или целевой мембраной, чтобы снизить пригодность к слиянию (34, 35).Связываясь с ГК и стабилизируя ее, арбидол сдвигает порог pH для конформационных изменений, вызывающих слияние, на ∼0,2–0,3 ед. В более кислом направлении (37, 38). Это примечательно, поскольку даже такие небольшие изменения рН слияния могут значительно повлиять на инфекционность вируса гриппа (67). Точно так же мы обнаружили, что арбидол сдвигает pH-зависимость диссоциации LASV GP1 от GP2 на ~ 0,5 ед. (В более кислую сторону). Считается, что это событие разжимает субъединицу слияния LASV (GP2), аналогично разжиманию гриппа HA2 и gp41 ВИЧ.Следовательно, в дополнение к его вероятным общим эффектам нарушения слияния, вызванным интеркаляцией в вирусную и / или эндосомную мембрану (35, 45, 66), вероятно, что арбидол дополнительно влияет на стабильность LASV GP аналогично его эффектам. на грипп HA (37–39). И, как описано в другом месте (36), арбидол также может влиять на стадии до или после слияния.

Терапевтический потенциал препаратов с аналогичной эффективностью против LASV и EBOV. Как указано во введении, долгосрочная цель состоит в том, чтобы идентифицировать лекарственный коктейль, который ингибирует как LASV, так и EBOV.Наше внимание уделяется перорально доступным, стабильным при комнатной температуре лекарствам, которые нацелены на процессы, общие для проникновения LASV и EBOV в клетки. В этом исследовании мы определили пять лекарств, которые нацелены на дискретные этапы входа и демонстрируют примерно одинаковую эффективность против LASV и EBOV GP-опосредованного входа: ингибитор макропиноцитоза зонипорид, ингибиторы закисления эндосом амодиахин и никлозамид, ингибитор трафика апилимод и ингибитор слияния. арбидол.

Хотя зонипорид не одобрен, он прошел стадию II клинических испытаний для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.В качестве альтернативы может иметь применение одобренный FDA лекарственный препарат арипипразол (торговое название Abilify). Арипипразол блокирует инфекцию EBOV и действует синергетически с другими ингибиторами проникновения (20, 23). Предварительные данные свидетельствуют о том, что он блокирует интернализацию частиц EBOV, а также LASV GP-опосредованную инфекцию (лаборатория Дж. М. Уайта, неопубликованные данные). Ингибиторы закисления эндосом амодиахин и никлозамид доступны перорально и одобрены FDA для лечения малярии и глистных заболеваний соответственно. Для обоих максимальная концентрация в сыворотке ( C _max ) находится в пределах диапазона IC ₅₀ для активности против EBOV / LASV (20–23, 57, 68, 69).Новые производные амодиахина (59) или синергетические пары препаратов, содержащие амодиахин или никлозамид и другой агент, могут снизить необходимые дозы (23). И хотя ингибитор трафика апилимод хорошо переносится и является мощным антагонистом EBOV и LASV (51, 53, 70; также это исследование), в раннем тесте он не защищал мышей от летального заражения EBOV (см. Ссылку 23), вероятно, из-за его ингибирования продукции интерлейкина 12/23 (IL-12/23) (ссылка 61 и К. Роджерс, Л. Штунц, О. Штанко, Л.Мэллинджер, Дж. М. Уайт, М. Шмидт, С. Варга, Н. Батлер, Г. Бишоп и У. Мори, представлены для публикации).

Среди протестированных ингибиторов слияния арбидол является кандидатом для дальнейшего рассмотрения, поскольку он показывает сходную активность против LASV и EBOV и, по нашим исследованиям, оказывается несколько более сильным против LASV- и EBOV GP- по сравнению с HA-опосредованным слиянием гриппа и Вход. Арбидол одобрен и используется в Китае и России против гриппа и показал поразительно широкую противовирусную активность (33, 36, 71).Однократная стандартная доза для человека (200 мг) арбидола дает на C _max меньше (33, 72–74), чем наше предварительное указание (рис. 3) его IC ₅₀ против подлинного LASV. Отметим, однако, что расчетные IC ₅₀ s для арбидола против аутентичного LASV (рис. 3) и гриппа (39, 45, 75) аналогичны (примерно ~ 10 мкМ; варьируются для разных штаммов вируса гриппа). Так как стандартная доза арбидола при гриппе составляет 200 мг три (72) или четыре (75) раза в день, а так как арбидол имеет длительный период полувыведения (36), чистый (совокупный) C _max при многократном ежедневном применении. ожидается, что дозировка будет значительно выше (M.Пейн, личное сообщение). Следовательно, поскольку стандартная доза арбидола клинически эффективна против гриппа (см., Например, ссылку 75), она может быть полезна против LASV и EBOV. Однако единственное заметное умеренное снижение титра (рис. 3) в сочетании с опытом с другим вирусом геморрагической лихорадки (76) свидетельствует против предложения арбидола в качестве самостоятельного терапевтического средства. Переносимая более высокая доза арбидола (74), нового производного арбидола (39, 44) или комбинация арбидола с другим лекарством (23, 77, 78) может снизить дозу, необходимую для достижения достижимой противовирусной эффективности. Что касается потенциального лекарственного коктейля, включающего арбидол, интересно, что, как сообщается, амантадин, римантадин, рибавирин и рибамидил усиливают активность арбидола против гриппа (79).

Мы предполагаем, что доступный для перорального приема, стабильный при комнатной температуре, одобренный препарат или коктейль из одобренных препаратов можно было бы быстро развернуть для лечения или профилактики (подозреваемых) случаев LASV и EBOV, особенно в регионах по всему миру, которые испытывают трудности с точки зрения ресурсов, инфраструктуры и доступности.Такое лекарство или лекарственный коктейль может быть ценным до того, как будет поставлен окончательный диагноз, одновременно с вакцинацией (например, для медицинских работников и / или первых ответчиков на вспышки) и / или во время установки кольцевой вакцинации. Здесь мы идентифицировали несколько препаратов с этими атрибутами, которые демонстрируют сходную степень ингибирования входа LASV и EBOV. Более того, три из них — амодиахин, никлозамид и арбидол — подавляют множественные вирусы в оболочке (33, 36, 57, 60, 71, 80–83). Следовательно, лекарство или лекарственный коктейль, содержащий эти лекарства, может ингибировать несколько вирусов в оболочке, которые проникают в клетки через эндоцитарный путь (49).

Оценка противовирусной эффективности рибавирина, арбидола и Т-705 (фавипиравира) на мышиной модели крымско-конголезской геморрагической лихорадки

Абстрактные

Фон

Мыши, лишенные рецептора интерферона типа I (мыши IFNAR ^{— / —} ), воспроизводят соответствующие аспекты крымско-конголезской геморрагической лихорадки (CCHF) у людей, включая повреждение печени. Мы стремились охарактеризовать патологию печени у мышей IFNAR ^{— / —} , инфицированных вирусом CCHF, с помощью иммуногистохимии и использовали модель для оценки противовирусной эффективности рибавирина, арбидола и Т-705 против вируса CCHF.

Методология / основные результаты

инфицированных вирусом CCHF IFNAR ^{— / —} мышей умерли через 2–6 дней после заражения с повышенным уровнем аминотрансферазы и высокими титрами вируса в крови и органах. Основным патологическим изменением был острый гепатит с обширным мостиковым некрозом, реактивная пролиферация гепатоцитов и легкая или умеренная воспалительная реакция с активацией моноцитов / макрофагов. В некротических областях скопились инфицированные вирусом и апоптотические гепатоциты. Рибавирин, арбидол и Т-705 подавляли репликацию вируса in vitro на ≥3 log единиц (IC ₅₀ 0.6–2,8 мкг / мл; IC ₉₀ 1,2–4,7 мкг / мл). Рибавирин [100 мг / (кг × день)] не увеличивал выживаемость мышей IFNAR ^{— / —} , но увеличивал время до смерти (p <0,001) и снижал уровни аминотрансферазы и титры вируса. Арбидол [150 мг / (кг × сут)] не имел эффективности in vivo . Животные, получавшие Т-705 через 1 час [15, 30 и 300 мг / (кг × день)] или до 2 дней [300 мг / (кг × день)] после заражения, выжили, не проявили никаких признаков заболевания и вирусов в крови и органах не было. Совместное введение рибавирина и Т-705 дало скорее положительные, чем побочные эффекты.

Выводы / Значение

Активированные печеночные макрофаги и клетки, происходящие из моноцитов, могут играть роль в провоспалительном цитокиновом ответе при CCHF. Скопление инфицированных гепатоцитов в некротических областях без выраженного воспаления указывает на вирусные цитопатические эффекты. Т-705 очень эффективен против вируса CCHF in vitro и in vivo . Его in vivo эффективность превышает эффективность существующего стандартного препарата для лечения CCHF, рибавирина.

Сведения об авторе

Крымско-конголезская геморрагическая лихорадка (КГЛ) является эндемическим заболеванием в Африке, Азии, Юго-Восточной Европе и на Ближнем Востоке.Летальность составляет 30–50%. Исследования по патофизиологии и лечению CCHF были затруднены из-за отсутствия подходящей модели на животных. Мы использовали инфицированных вирусом CCHF трансгенных мышей с дефектом врожденного иммунного ответа в качестве модели заболевания. Эти мыши умирают от инфекции и проявляют признаки заболевания, аналогичные тем, которые обнаруживаются у людей. Во-первых, мы изучили патологию печени у животных, поскольку некроз печени является характерной особенностью CCHF человека. Во-вторых, мы использовали модель для проверки эффективности противовирусных препаратов, которые используются в клинической практике или на продвинутой стадии клинических испытаний.Помимо рибавирина, стандартного препарата для лечения ГКГН, мы протестировали арбидол, препарат, применяемый в клинической практике против респираторных инфекций, и Т-705, новый препарат, находящийся в клинической разработке для лечения инфекции вируса гриппа. В то время как рибавирин и арбидол показали некоторый положительный эффект или не показали его, соответственно, Т-705 был очень эффективен в модели на животных. Эти данные обещают клиническую эффективность Т-705 при CCHF человека.

Образец цитирования: Oestereich L, Rieger T, Neumann M, Bernreuther C, Lehmann M, Krasemann S, et al.(2014) Оценка противовирусной эффективности рибавирина, арбидола и Т-705 (фавипиравира) на мышиной модели крымско-конголезской геморрагической лихорадки. PLoS Negl Trop Dis 8 (5):
e2804.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002804

Редактор: Сунит Кумар Сингх, Центр клеточной и молекулярной биологии (CCMB), Индия

Поступила: 25 августа 2013 г .; Принята к печати: 9 марта 2014 г .; Опубликован: 1 мая 2014 г.

Авторские права: © 2014 Oestereich et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Это исследование было поддержано грантами FP7 228292 (Европейский вирусный архив) и 260644 (низкомолекулярные ингибиторы-лидеры по сравнению с появляющимися и забытыми РНК-вирусами) Европейского сообщества. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Вирус Крымско-Конго геморрагической лихорадки (CCHFV) представляет собой РНК-вирус с отрицательной цепью, принадлежащий к роду Nairovirus семейства Bunyaviridae . Вирус эндемичен в Африке, Азии, Юго-Восточной Европе и на Ближнем Востоке. Клещи Hyalomma передают вирус людям, диким животным и животным. Люди также могут заразиться при контакте с зараженным домашним скотом.Передача от человека к человеку происходит в основном в больничных условиях. У людей вирус вызывает лихорадочное заболевание, которое может быть связано с кровотечением, некрозом печени, шоком и полиорганной недостаточностью. Другими отличительными признаками заболевания являются повышенные уровни сывороточного аспартата и аланинаминотрансферазы (AST и ALT соответственно), тромбоцитопения и диссеминированная внутрисосудистая коагулопатия. Средняя летальность составляет 30–50%, но может быть выше при внутрибольничных вспышках [1] — [5].

Патофизиология болезни изучена недостаточно.Считается, что повреждение эндотелиальных клеток и клеток печени, индукция провоспалительных цитокинов и нарушение регуляции каскада коагуляции играют роль [3] — [8]. Исследования патофизиологии крымско-конголезской геморрагической лихорадки (КГЛ) затруднены из-за отсутствия подходящей модели на животных, поскольку до сих пор не описано ни одного млекопитающего с полностью функциональной иммунной системой, за исключением людей, у которого при заражении развивается болезнь. Первой животной моделью была новорожденная мышь [9]. Недавно были описаны две модели трансгенных мышей для CCHF: во-первых, у мышей, лишенных преобразователя сигнала и активатора транскрипции 1 (мыши STAT1 ^{— / —} ), и во-вторых, у мышей, лишенных рецептора интерферона типа I (альфа / бета) (IFNAR). ^{— / —} мышей) [10] — [12].Обе мыши с нокаутом имеют дефект врожденного иммунного ответа, быстро умирают от инфекции CCHFV и воспроизводят соответствующие аспекты CCHF человека. В суррогатных моделях CCHF используются мыши IFNAR ^{— / —} , инфицированные вирусом Dugbe или Hazara [13], [14], двумя наировирусами, связанными с CCHFV, которые, как известно, не вызывают заболевания у человека. Работа с этими моделями может осуществляться на уровне биобезопасности (BSL) -2, в то время как для работы с инфекционными CCHFV необходимы средства BSL-4.

В настоящем исследовании мы стремились более подробно охарактеризовать патологические изменения в печени мышей IFNAR ^{— / —} , инфицированных CCHFV.Кроме того, мы использовали эту модель для оценки противовирусной эффективности рибавирина, арбидола и Т-705 (фавипиравира) против CCHFV in vivo . Эти препараты либо используются в клинической практике, либо находятся на продвинутой стадии клинических испытаний. Рибавирин ингибирует репликацию CCHFV в культуре клеток [15] и вводят пациентам ККГЛ, хотя его клинический эффект не доказано и обсуждаются спорно [16] — [19]. Он показывает положительные эффекты на неонатальных моделях мышей и STAT1 ^{— / —} [9], [10].Рибавирин в настоящее время является единственным препаратом, доступным для лечения хронической сердечной недостаточности. Арбидол представляет собой противовирусное средство широкого спектра действия, проявляющее активность против ряда РНК-вирусов in vitro и in vivo , в первую очередь вируса гриппа A [20] — [24]. В России и Китае препарат клинически используется в основном для профилактики и лечения острых респираторных инфекций, в том числе гриппа. Предполагается, что арбидол действует посредством гидрофобных взаимодействий с мембранами и вирусными белками, таким образом подавляя слияние и проникновение вируса [25] — [27].Т-705 является мощным ингибитором in vitro и на животных моделях вируса гриппа, флебовирусов, хантавирусов, аренавирусов, альфавирусов, пикорнавирусов и норовирусов [28] — [35]. После преобразования в Т-705-рибофуранозил-5′-трифосфат, он предположительно действует как аналог нуклеотида, который избирательно ингибирует вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу или вызывает летальный мутагенез при включении в вирусную РНК [36] — [40]. Т-705 (фавипиравир) в настоящее время находится на поздней стадии клинических разработок для лечения вирусной инфекции гриппа.

Материалы и методы

Заявление об этике

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями Немецкого общества лабораторных животных под наблюдением ветеринара. Протокол был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных города Гамбурга (разрешение № 44/11). Были предприняты все усилия, чтобы минимизировать количество животных, используемых для экспериментов, и уменьшить страдания животных во время экспериментов.Весь персонал, проводящий эксперименты на животных, прошел программу обучения и подготовки в соответствии с категорией B или C Федерации европейских ассоциаций лабораторных зоотехников. Об экспериментах на животных в этом исследовании сообщается в соответствии с рекомендациями ARRIVE [41]. В этом исследовании было использовано 162 мыши, и все мыши были включены в анализ.

Вирусов

Штамм

CCHFV Afg-09 2990 был выделен в 2009 г. в нашей лаборатории от пациента со смертельным течением инфекции [42] и дважды пассирован перед использованием в этом исследовании.Запас вируса выращивали на клетках Vero E6, количественно определяли иммунофокусным анализом (см. Ниже) и хранили при -70 ° C до использования в экспериментах in vitro и in vivo .

Противовирусные препараты

Рибавирин (номер CAS 36791-04-5; PubChem CID 37542) был получен от MP Biomedicals (номер заказа 02196066), арбидола гидрохлорид (номер CAS 131707-23-8; PubChem CID 131410) от Waterstone Technology, США ( номер заказа 49823), а Т-705 (фавипиравир; номер CAS 259793-96-9; PubChem CID 492405) был специально синтезирован BOC Sciences, Creative Dynamics, США.

Тестирование противовирусных препаратов и токсичности в культуре клеток

Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации примерно 10 мг / мл и хранили при -20 ° C. Конечная концентрация ДМСО в супернатанте клеточной культуры составляла 0,1%. Клетки Vero E6 выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (PAA Laboratories) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и стрептомицином / пенициллином, и высевали при плотности 4 × 10 ⁴ клеток на лунку 24- лунный планшет за 1 день до заражения.Клетки инокулировали CCHFV при множественности инфицирования (MOI) 0,01 в лаборатории BSL-4. Посевной материал удаляли через 1 ч и заменяли свежей средой с различными концентрациями соединения. Для экспериментов с арбидолом клетки дополнительно обрабатывали арбидолом за 18 ч до заражения. Концентрацию инфекционных вирусных частиц в супернатанте клеточной культуры измеряли через 2–4 дня после инфицирования (p.i.) с помощью иммунофокусного анализа. Рост и жизнеспособность клеток при обработке соединением определяли методом 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил-2H-тетразолийбромида (МТТ), как описано [43].Сигмоидальная кривая доза-ответ была подогнана к данным с использованием Prism GraphPad 6.0 (программное обеспечение GraphPad). Ингибирующие концентрации, которые снижали титр вируса на 50%, 90% и 99% (IC ₅₀ , IC ₉₀ и IC ₉₉ , соответственно), и цитотоксические концентрации, которые снижали рост клеток на 50% и 90%. % (CC ₅₀ и CC ₉₀ соответственно) были рассчитаны из сигмоидальных функций.

Для анализа комбинаций двух препаратов была протестирована матрица концентраций 8 × 8.Лекарства x и y испытывали в концентрациях c = 0; IC ₉₀ /8; IC ₉₀ /4; IC ₉₀ /2; IC ₉₀ ; IC ₉₀ • 2; IC ₉₀ • 4; IC ₉₀ • 8 во всех возможных комбинациях ( c _x , c _y ). Значения IC ₉₀ были получены из предыдущих экспериментов с одним лекарством. Данные комбинации лекарственных препаратов анализировали с использованием модели взаимодействия лекарственных средств независимости Блисса [44].Эта модель определяется уравнением E _xy = E _x + E _y — ( E _x • E _y ), где E _xy — это аддитивный эффект лекарств x и y , предсказанный их индивидуальными эффектами E _x и E _y . E _x = ( V _obs (0,0) — V _obs ( c _x , 0)) / V _obs (0,0) и E _y = ( V _obs (0,0) — V _obs (0, c _y )) / V _obs (0,0), где V _obs ( c _x , c _y ) — наблюдаемое, т.е.е. экспериментально определенный титр вируса для ( c _x , c _y ). По аналогии с программой MacSynergy II [44], [45], которая оценивает антивирусные данные в соответствии с моделью независимости Блисса, был использован трехмерный подход для определения областей, в которых наблюдаемые эффекты больше (синергия) или меньше (антагонизм), чем предсказанные E _xy . С этой целью соотношение между прогнозируемым титром вируса V _pred ( c _x , c _y ) = V _obs (0,0) • (1− E _xy ) и наблюдаемый титр вируса V _obs ( c _x , c _y ) был рассчитан для каждой комбинации препаратов ( c _x , c _y ) .Отношение> 1 указывает на синергию (т.е. для ( c _x , c _y ) титр вируса, предсказанный для аддитивного эффекта, выше, чем экспериментально определенный титр вируса), соотношение <1 указывает на антагонизм (т.е. ( c _x , c _y ) титр вируса для прогнозируемого аддитивного эффекта ниже, чем титр вируса, определенный экспериментально).

Эксперименты на мышах

IFNAR ^{— / —} мышей (фон 129Sv) [46] были выведены в учреждении для животных, свободных от специфических патогенов, Института Бернхарда-Нохта.Во всех экспериментах использовали самок животных в возрасте от шести до двенадцати недель (средний вес 20 г, диапазон 15-24 г), за исключением девяти самцов, которые использовались для определения летальной дозы вируса. Ожидалось, что размер группы из 5 животных обеспечит достаточно точные оценки выживаемости, вирусемии и параметров клинической химии. Это позволяет выявить 80% -ную разницу в выживаемости между контрольной группой и группой лечения с p (альфа) = 0,05 и степенью (1 — бета) = 0,8. Экспериментальные группы были сопоставимы по возрасту.От трех до пяти животных в группе содержали вместе в обычной клетке без обогащения. У них был доступ к пище и воде ad libitum . Эксперименты по заражению CCHFV проводились в помещении для животных лаборатории BSL-4 с искусственными циклами свет / темнота.

От трех до десяти животных в группе (в зависимости от того, планировался ли сбор органов) инфицировали внутрибрюшинной (i.p.) инъекцией от 0,3 до 10 ⁴ фокусообразующих единиц (FFU) CCHFV в 100 или 200 мкл DMEM, содержащей 2% FCS.Способ введения был выбран для облегчения сопоставимости с ранее описанными моделями мышей CCHF [10], [11]. После заражения мышей ежедневно контролировали на предмет признаков заболевания, а массу тела и ректальную температуру тела измеряли с помощью термометра BIO-TK8851 с ректальным датчиком BIO-BRET-3 для мышей (Bioseb, Франция). Животных с тяжелыми признаками заболевания, такими как судороги, кровотечение, вздутие живота, диарея, агония или потеря веса> 15% в течение 2 дней, умерщвляли. Образцы крови 30–80 мкл на животное отбирали путем пункции хвостовой вены с интервалами 1–4 дня в течение 14 дней (всего ≤5 заборов крови) для клинической биохимии и измерения вирусемии.Что касается сбора органов, то при соблюдении критериев эвтаназии и в конце эксперимента животных умерщвляли передозировкой изофлурана с последующим смещением шейки матки. Органы собирали после смерти или на 3-е сутки. от 2–3 животных, которые были случайным образом выбраны из экспериментальных групп по 7–10 животных и проанализированы на титр инфекционного вируса и гистопатологические изменения. Опыты не повторялись.

Тестирование противовирусных препаратов и токсичности

in vivo

Рибавирин вводили один раз в день i.п. маршрут. Перед каждым применением готовили запас 10 мг / мл в 0,9% NaCl. Животные получали дозу рибавирина 100 мг / (кг × сут) (200 мкл для 20-граммовой мыши) или 200 мкл 0,9% NaCl в качестве плацебо. Доза рибавирина, смертельная для 50% мышей (LD ₅₀ ), составляет 220 мг / (кг × сут) [47]. Лечение было начато через 1 час. и продолжали до смерти или 8-го дня. Арбидол вводили перорально один раз в день с помощью желудочного зонда. Суспензии 15 или 30 мг / мл в 0,5% метилцеллюлозе готовили перед каждым применением.Животные получали арбидол в дозе 75 или 150 мг / (кг × сут) (100 мкл суспензии для 20-граммовой мыши) или 100 мкл 0,5% метилцеллюлозы в качестве плацебо. Лечение начинали за 1 день до заражения и продолжали до смерти или 8 дня. In vivo Токсичность арбидола оценивали на 26 неинфицированных животных, получавших 0, 25, 75, 150, 300 или 600 мг / (кг × день) для 8 дн. В этом диапазоне доз токсических эффектов не наблюдалось. Т-705 вводили перорально дважды в день с помощью желудочного зонда. Подвески 0.Ежедневно готовили 75, 1,5, 3 или 30 мг / мл в 0,5% метилцеллюлозе. Животные получали дозу Т-705 7,5, 15, 30 или 300 мг / (кг × сут) (100 мкл суспензии два раза в день для 20-граммовой мыши) или 100 мкл 0,5% метилцеллюлозы два раза в день. Лечение было начато через 1 час. или позже и продолжалось до смерти или 8-го дня.

Титрование вирусов и антител

Частицы инфекционного вируса в крови и образцах органов определялись иммунофокусным методом. Образцы органов гомогенизировали в 500 мкл DMEM – 2% FCS с использованием Lysing Matrix D (MP Biomedicals) в битовой мельнице.Клетки Vero в 24-луночных планшетах инокулировали 200 мкл последовательных 10-кратных разведений образца. Посевной материал удаляли через 1 час и заменяли слоем 1% -метилцеллюлоза – DMEM – 6% FCS. После 5 дней инкубации клетки фиксировали 4% формальдегидом в фосфатно-солевом буфере (PBS), промывали водой и повышали проницаемость 0,5% Triton X-100 в PBS. После промывки и блокирования 10% FCS в PBS очаги инфицированных клеток выявляли с помощью специфичного к нуклеопротеину (NP) CCHFV моноклонального антитела A4 [48].После промывания клетки инкубировали с меченным пероксидазой антимышиным IgG. Очаги визуализировали с помощью тетраметилбензидина и подсчитывали.

Вирусспецифические антитела в крови были обнаружены с помощью иммунофлуоресцентного анализа (IFA) с использованием клеток, инфицированных штаммом CCHFV Afg-09 2990 в качестве антигена. Сыворотку мышей инактивировали в течение 1 ч при 60 ° C и тестировали при разведении 1∶20.

Клиническая химия

Образцы сыворотки разбавляли 1∶10 или выше, при необходимости, в 0,9% NaCl и анализировали на активность AST и ALT с использованием имеющихся в продаже наборов для колориметрического анализа при 25 ° C (предел обнаружения для неразбавленной сыворотки равен 2.25 Ед / л для АСТ и 2,65 Е / л для АЛТ) (Reflotron, Roche Diagnostics). Параметры измеряли для отдельных животных.

Гистология и иммуногистохимия

Легкие, почки, сердце, селезенка, головной мозг и печень собирали, фиксировали в 4% формальдегиде в PBS и заливали парафином с использованием тканевого процессора Leica ASP300 S и станции для заливки Leica EG1160 (Leica). Срезы (4 мкм) окрашивали гематоксилин-эозином (H&E) или обрабатывали для иммуногистохимии (IHC). Срезы ИГХ окрашивали с использованием автоматической системы окрашивания Ventana BenchMark XT (Ventana Medical Systems) и раствора для кондиционирования клеток 1 или 2 (Ventana) в течение 30–60 мин.Срезы инкубировали с первичными антителами, направленными против B-клеточного маркера B220 (1-400; eBioscience), каспазы-3, расщепленной маркером апоптоза (1-100; R&D Systems), Т-клеточного маркера CD3 (1-100; Dako), миелоидного происхождения. клеточный (например, макрофагальный) маркер Iba-1 (1-2000; Wako Chemicals), индуцибельная синтаза оксида азота (iNOS), экспрессируемая активированными клетками, происходящими из моноцитов (1-50; Abcam), и маркер пролиферации клеток Ki67 (1-250; Abcam) на 1 час. Первичные антитела выявляли с помощью иммуноферментного полимера против IgG мыши, кроличьего IgG или IgG крысы. Histofine Simple Stain MAX PO (Nichirei Biosciences) и окрашивали субстратом 3,3′-диаминобензидина (DAB) с использованием UltraView Universal. Комплект обнаружения DAB (Ventana).Клетки контрастировали гематоксилином. ИГХ с первичными антителами, направленными против NP CCHFV (моноклональное антитело A4 [48], 1–500) и маркера нейтрофилов Ly6G (1–1000; BD Bioscience), выполняли вручную. Срезы кипятили в цитратном буфере (pH 6) в течение 1 ч и инкубировали с антителом при 4 ° C в течение ночи. Первичные антитела выявляли с помощью иммуноферментного полимера против IgG мыши Histofine Simple Stain AP или иммуноферментного полимера против IgG G Histofine Simple Stain MAX PO и окрашивали субстратом Fast Red (Roche) или DAB (Sigma-Aldrich), соответственно.Для контрастного окрашивания использовали раствор гематоксилина Майера. Срезы закрывали монтажной средой Tissue Tek (Sakura Finetek).

Статистический анализ

Статистический анализ выполнялся с помощью GraphPad 6.0 (программное обеспечение GraphPad). Непарные группы сравнивались с двусторонним U-критерием Манна – Уитни для непрерывных параметров и с двусторонним точным критерием Фишера для частот. Кривые выживаемости сравнивались с логранговым тестом (Мантел-Кокса).

Результаты

Оптимизация модели мыши IFNAR

^{— / —} для антивирусного тестирования

Перед тестированием противовирусных препаратов на мышиной модели IFNAR ^{— / —} мы стремились определить оптимальную инфекционную дозу для штамма CCHFV Afg09-2990 и охарактеризовать заболевание, вызываемое этим конкретным штаммом.С этой целью мышей IFNAR ^{— / —} инфицировали i.p. с 0,3, 1, 3, 10, 100, 1000 и 10 000 FFU. Животные умерли от инфекции даже после инокуляции 0,3 FFU (инокулят, погибшие / инфицированные: 0,3 FFU, 4/5; 1 FFU, 5/5; 3 FFU, 4/5; 10 FFU, 6/8; 100 FFU 13 / 13; 1000 FFU, 8/8; 10,000 FFU, 3/3). Это указывает на то, что только нескольких инфекционных вирусных частиц штамма CCHFV Afg09-2990 достаточно, чтобы инициировать продуктивную инфекцию. Летальный исход постоянно наблюдался при ≥100 FFU. Таким образом, модель была дополнительно охарактеризована для доз инокуляции 10, 100, 1000 и 10000 FFU (рис.1). Животные, инфицированные 100 или 1000 FFU, умирали между 3 и 6 днями, в то время как животные, инфицированные 10 000 FFU, равномерно умирали на 2 день. Перед смертью животные потеряли около 15% массы тела (рис. 1). На 2-й день средние значения АСТ и АЛТ составляли около 300 Ед / л и 100 Ед / л, соответственно, у животных, которым вводили 100–1000 FFU. Оба значения были выше в группе 10 000 FFU (AST 1600 U / л и ALT 500 U / л) (рис. 1). Повышение АСТ и АЛТ указывает на повреждение клеток, в частности клеток печени. На 2-й день титр вируса в крови колебался от уровня ниже обнаруживаемой в группе 10 FFU, через 3 log ₁₀ FFU / мл в группах 100 и 1000 FFU, до 5 log ₁₀ FFU / мл в 10 000 FFU. группа (рис.1). На 3-й день вирус был обнаружен во всех проанализированных органах (селезенка, почки, печень, сердце, легкие и мозг) с титрами в диапазоне 4–7 log ₁₀ FFU / g независимо от дозы инокуляции (рис. 1). Максимальная концентрация вируса обнаружена в печени. Поскольку инокуляция ≤10 FFU не всегда приводила к летальному исходу, а инокуляция 10 000 FFU оставляла только 2 дня между инфицированием и летальным исходом для терапевтического вмешательства, дальнейшие эксперименты были проведены с дозой 100 или 1000 FFU.

Рисунок 1.Выживаемость, масса тела, АСТ, АЛТ и титр вируса в крови и органах мышей IFNAR ^{— / —} , инфицированных различными дозами CCHFV.

Мышей инокулировали i.p. с 10, 100, 1000 или 10000 FFU вируса. Титры органов определяли у животных, которые умерли от инфекции или подверглись эвтаназии из-за тяжести заболевания. Среднее и стандартное отклонение показаны для титров органов, преобразованных по массе и логарифмически. Вертикальные полосы на графиках для AST и ALT (обратите внимание на логарифмическую шкалу оси Y) и логарифмически преобразованные титры вирусов в крови представляют собой средние значения.Данные для групп 100 и 1000 FFU наивных животных были объединены с соответствующими данными из контрольных групп плацебо, показанными на рис. 5, чтобы обеспечить более надежные оценки параметров. Серым цветом выделен диапазон виремии ниже предела обнаружения иммунофокусного анализа, а также нормальный референсный диапазон АСТ и АЛТ у мышей [59]. Ноты. Группа 10 FFU: 2 выживших животных не показали ни повышения AST / ALT, ни виремии на 4 день (значение ALT для одного животного не определялось). Группа 100 FFU: животное, которое умерло на 6 день, не показало повышения AST / ALT и виремии на 2 и 4 дни.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002804.g001

Гистопатологические корреляты болезни

Легкие, сердце, почки, мозг, печень и селезенка мышей IFNAR ^{— / —} , инфицированных CCHFV, собирали на 3 день и оценивали на срезах, окрашенных H и E. Распределение вируса во всех органах и воспалительный ответ в печени визуализировали с помощью ИГХ. Наивные мыши IFNAR ^{— / —} служили контролем.

Печень.

В печени мышей IFNAR ^{— / —} , инфицированных CCHFV, обнаружен острый гепатит с обширным мостиковым гепатоцеллюлярным некрозом и воспалительной реакцией от легкой до умеренной (рис.2). В некротизированных областях обнаружено накопление NP CCHFV в гепатоцитах (рис. 2) и расщепленных каспазо-3-положительных (апоптотических) гепатоцитах (рис. 3). Клеточная пролиферация, определяемая окрашиванием ядерного антигена Ki67, была увеличена. Хотя большинство Ki67-положительных клеток можно отнести к воспалительной реакции, пролиферация гепатоцитов также была очевидна (рис. 3). Архитектура Iba-1-положительных макрофагов (клеток Купфера) в некротических областях была нарушена; клетки показали увеличенные тела клеток и очаговую кластеризацию (рис.3). Кроме того, были обнаружены экспрессирующие iNOS активированные клетки, происходящие из моноцитов, которых нет в нормальной печени (рис. 3). Эти изменения указывают на активацию моноцитов / макрофагов. Количество CD3-позитивных Т-клеток, B220-позитивных В-клеток и Ly6G-позитивных гранулоцитов было немного увеличено (рис. 3).

Рисунок 2. Гистопатология и распределение вирусного антигена в печени и селезенке наивных и инфицированных CCHFV мышей IFNAR ^{— / —} и эффект лечения рибавирином и Т-705.

Животных инокулировали i.p. с 100 FFU CCHFV. Вверху: печень была собрана (i) у наивных животных (ii) у животных, которые скончались от инфекции без лечения на 3 день p.i., (iii) которые умерли от инфекции на 9 день p.i. после обработки рибавирином 100 мг / (кг × сут) и (iv) умерщвлены на 3-й день p.i. во время обработки Т-705 300 мг / (кг × сут). Лечение рибавирином или Т-705 начинали через 1 час в день. и продолжали до смерти или до 8-го дня. Внизу: селезенку собирали у наивных животных и животных, которые скончались от инфекции без лечения на 3-й день.я. Срезы окрашивали H&E, и распределение CCHFV в ткани визуализировали с использованием моноклональных антител против CCHFV NP. Патогистологические данные являются репрезентативными для 2–3 животных, анализируемых в каждой группе. Шкала шкалы = 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002804.g002

Рис. 3. ИГХ для маркеров воспаления, апоптоза и пролиферации в печени наивных и инфицированных CCHFV мышей IFNAR ^{— / —} и эффект лечения рибавирином и Т-705.

Животных инокулировали i.p. с 100 FFU CCHFV. Печень собирали (i) у наивных животных (ii) у животных, которые умерли от инфекции без лечения на 3-й день p.i., (iii) которые умерли от инфекции на 9-й день p.i. после обработки рибавирином 100 мг / (кг × сут) и (iv) умерщвлены на 3-й день p.i. во время обработки Т-705 300 мг / (кг × сут). Лечение рибавирином или Т-705 начинали через 1 час в день. и продолжали до смерти или 8-го дня. Срезы окрашивали антителами против CD3, B220, Ly6G, Iba-1, iNOS, расщепленной каспазы-3 и Ki67.Т-клетки отмечены стрелками, поскольку антитело против CD3 демонстрирует некоторую ложную перекрестную реактивность. Патогистологические данные являются репрезентативными для 2–3 животных, анализируемых в каждой группе. Шкала шкалы = 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002804.g003

Селезенка.

В селезенке мышей, инфицированных CCHFV, обнаружено умеренно пониженное количество лимфоцитов и повышенное количество клеточного дебриса в красной и белой пульпе. Кроме того, количество мегакариоцитов уменьшилось (рис.2). CCHFV NP был обнаружен в клетках селезенки, хотя сигналы были гораздо менее интенсивными, чем в печени (рис. 2).

Легкое, сердце, почки и мозг.

Гистопатологический анализ не выявил каких-либо явных различий в тканях легких, сердца, почек и головного мозга между CCHFV-инфицированными и наивными мышами. Уровень антигена вируса был ниже предела обнаружения ИГХ (данные не показаны).

Таким образом, у мышей IFNAR ^{— / —} , инфицированных CCHFV, наблюдались патологические изменения в печени и селезенке.Основным результатом был острый гепатит с обширным некрозом, реактивной пролиферацией гепатоцитов, легкой или умеренной воспалительной реакцией и морфологическими признаками активации моноцитов / макрофагов. CCHFV-инфицированные и апоптотические гепатоциты сгруппированы в некротических областях.

Тестирование противовирусных препаратов и токсичности

in vitro

Противовирусная активность рибавирина, арбидола гидрохлорида и Т-705 против штамма CCHFV Afg09-2990 была протестирована на клетках Vero E6. Все три соединения были способны подавлять репликацию вируса на 3–4 log ₁₀ единиц при концентрациях ≥10 мкг / мл (рис.4). Значения IC ₅₀ и IC ₉₀ находились в диапазоне 0,6–2,8 мкг / мл и 1,2–4,7 мкг / мл соответственно. Значения IC ₉₉ находились в диапазоне 2,0–9,5 мкг / мл. Токсичность клеток в тестовом диапазоне, измеренная с помощью теста МТТ, была очевидна только для гидрохлорида арбидола (рибавирин CC ₅₀ > 32 мкг / мл; гидрохлорид арбидола CC ₅₀ 8,3 мкг / мл, CC ₉₀ 20 мкг / мл; T -705 CC ₅₀ > 15 мкг / мл) (рис. 4). В заключение, все три соединения показали мощный противовирусный эффект против CCHFV Afg09-2990 в культуре клеток.Арбидол проявил токсичность с терапевтическим индексом около 10.

.

Рис. 4. Тестирование противовирусной активности рибавирина, арбидола гидрохлорида и Т-705 в культуре клеток.

Клетки Vero E6 инокулировали CCHFV с MOI 0,01 и добавляли соединение 1–4 дня p.i. иммунофокусом. Рост и жизнеспособность клеток при обработке соединения определяли методом МТТ. Кривые доза-ответ были подогнаны к данным. На графиках показаны репрезентативные эксперименты с точками данных, представляющими среднее значение и стандартное отклонение ≥3 повторов.Значения IC ₅₀ , IC ₉₀ и IC ₉₉ были рассчитаны из сигмоидальных функций 2–3 независимых экспериментов и показаны под графиками (среднее значение и диапазон).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002804.g004

Противовирусное тестирование

in vivo

Рибавирин сравнивали с группой плацебо, получавшей носитель (0,9% раствор NaCl) (рис. 5). Обе группы мышей IFNAR ^{— / —} были инфицированы 100 FFU CCHFV.Хотя одно животное выжило после лечения, рибавирин существенно не увеличил выживаемость (p = 0,4). Однако препарат увеличивал время до смерти (медиана 3 дней по сравнению с 6 днями для плацебо по сравнению с рибавирином, p = 0,0007), снижал уровни AST (p = 0,001) и ALT (p = 0,006) на 2-й день, уменьшал титр вируса в крови на 2-й день (p = 0,0007), увеличение веса на 2-й и 3-й день (p = 0,03 и p = 0,002, соответственно) и снижение конечной концентрации вируса во всех органах по сравнению с плацебо на 3-й день ( р <0.001 отдельно для каждого органа). Гистопатологический анализ органов, собранных на 3-й день у мышей, получавших рибавирин, выявил только небольшие диссеминированные очаги некроза; большая часть паренхимы печени напоминала наивных мышей. Заметное снижение гепатоцеллюлярного некроза коррелировало с низким количеством апоптозных гепатоцитов (расщепленная каспаза-3), Т-клеток (CD3), B-клеток (B220) и активированных клеток, полученных из моноцитов (iNOS). Антиген-положительные клетки (NP) вируса были значительно уменьшены в печени и селезенке по сравнению с необработанными мышами или мышами, получавшими плацебо (данные не показаны).Однако у мышей, получавших рибавирин, которые скончались от инфекции на 4–9 дни, к моменту смерти был обнаружен обширный мостиковый гепатоцеллюлярный некроз (рис. 2). Как и у необработанных мышей, некроз сопровождался присутствием многочисленных Iba-1-положительных макрофагов (клеток Купфера), демонстрирующих увеличенные тела клеток и очаговую кластеризацию, а также экспрессирующие iNOS активированные клетки, происходящие из моноцитов (рис. 3). Оба изменения указывают на сильную активацию моноцитов / макрофагов. Однако, в отличие от необработанных мышей, вирусный антиген с трудом обнаруживался в ткани печени обработанных мышей (рис.2), что соответствует низкому титру вируса во всех органах (рис. 5, внизу). Таким образом, рибавирин снижает нагрузку CCHFV и задерживает прогрессирование заболевания, но он не предотвращает терминальный некроз печени, активацию моноцитов / макрофагов и летальный исход на мышиной модели IFNAR ^{— / —} .

Рисунок 5. Лечение инфицированных CCHFV мышей IFNAR ^{— / —} рибавирином и арбидол гидрохлоридом.

Мышей инокулировали i.p. с 10, 100 или 1000 FFU вируса. Рибавирин вводили i.п. раз в день. Животные получали дозу рибавирина 100 / (кг × сут) или 0,9% NaCl в качестве плацебо. Лечение было начато через 1 час. и продолжали до смерти или 8-го дня. Арбидол вводили перорально один раз в день с помощью желудочного зонда. Животные получали арбидол в дозе 150 мг / (кг × сут) или 0,5% метилцеллюлозы в качестве плацебо. Лечение начинали за 1 день до заражения и продолжали до смерти или 8-го дня. Титры органов определяли у животных, которые умерли от инфекции или должны были быть подвергнуты эвтаназии из-за тяжести заболевания.Кроме того, три животных из группы, получавшей рибавирин, были случайным образом умерщвлены на 3-й день p.i. для определения титра вируса в органах (данные о весе, AST, ALT и виремии, полученные от этих мышей до дня 3, были включены в соответствующие графики). Среднее и стандартное отклонение показаны для титров органов, преобразованных по массе и логарифмически. Вертикальные полосы на графиках для AST и ALT (обратите внимание на логарифмическую шкалу оси Y) и логарифмически преобразованные титры вирусов в крови представляют собой средние значения. Продолжительность лечения на графиках выживаемости, диапазон виремии ниже предела обнаружения иммунофокусного анализа, а также нормальный референсный диапазон АСТ и АЛТ у мышей [59] заштрихованы серым цветом.Ноты. Группа 100 FFU плацебо: животное, которое умерло на 6 день, не показало повышения AST / ALT и виремии на 4 день. Группа 100 FFU рибавирина: у выжившего животного не обнаруживалась виреемия, но наблюдалось повышение AST. Виремия не определялась на 11-й день. Группа 10 FFU арбидола: у выжившего животного не было повышения уровня АСТ и виремии на 4-й день. Некоторые значения для дней 4, 8 и 11 не определялись из-за недостаточного количества крови.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002804.g005

Гидрохлорид арбидола [75 и 150 мг / (кг × день)] был протестирован по сравнению с группой плацебо, получавшей носитель (0,5% метилцеллюлозы) [Рис. 5 и данные не показаны для 75 мг / (кг × сут)]. Обе группы были инфицированы 1000 FFU CCHFV. За день до инокуляции мышей предварительно обрабатывали. Однако препарат не изменил ни выживаемость, ни время выживания, ни какой-либо другой измеренный параметр. Даже снижение дозы инокуляции до 10 FFU не имело никакого эффекта по сравнению с исторической контрольной группой.

T-705 был протестирован в сравнении с группой плацебо, получавшей носитель (0,5% метилцеллюлозы) (фиг. 6). Все группы были инфицированы 100 FFU CCHFV. Первоначально была протестирована высокая доза Т-705 [300 мг / (кг × сут)]. Препарат вводили с 0 по 8 день. Животные, получавшие плацебо, умерли между 3 и 4 днями. На 3 день они показали потерю веса почти на 20%, повышение температуры тела до 40 ° C, значения AST 1 200–2 51 000 Ед / л и значения АЛТ 260–6 700 Ед / л. Все животные экспериментальной группы пережили инфекцию и не проявили никаких признаков заболевания.Вирус не обнаружен ни в крови, ни в органах на протяжении всего периода наблюдения (рис. 6 и данные не представлены). Гистопатология и ИГХ на 3-й день выявили в основном нормальную ткань печени без вирусного антигена и воспалительных клеток (рис. 2 и 3).

Фигура 6. Обработка инфицированных CCHFV мышей IFNAR ^{— / —} Т-705 и эксперименты по времени добавления.

Мышей инокулировали i.p. с 100 FFU вируса. Т-705 вводили перорально дважды в день с помощью желудочного зонда.Животные получали дозу Т-705 300 мг / (кг × сут) или 0,5% метилцеллюлозы в качестве плацебо. Лечение начинали через 1 час, 1 день или 2 дня каждый день. и продолжали до смерти или до 8-го дня. Двух животных на схему лечения умерщвляли на 3-й день p.i. для определения титра вируса в органах. Среднее и стандартное отклонение показаны для веса и температуры. Вертикальные полосы на графиках для AST и ALT (обратите внимание на логарифмическую шкалу оси Y) и логарифмически преобразованные титры вирусов в крови представляют собой средние значения. Продолжительность лечения на графиках выживаемости, диапазон виремии ниже предела обнаружения иммунофокусного анализа, а также нормальный референсный диапазон АСТ и АЛТ у мышей [59] заштрихованы серым цветом.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002804.g006

Для определения эффективности препарата на поздней стадии инфекции были проведены эксперименты по времени добавления (рис. 6). Лечение высокой дозой лекарственного средства начинали через 1 день или 2 дня после инокуляции вируса и продолжали до 8 дня. Выживаемость составляла 100% в обеих группах, и животные почти не проявляли никаких признаков заболевания. Только если лечение начиналось через 2 дня p.i., незначительные изменения веса, температуры и AST наблюдались на 3 день.Вирус оставался не обнаруживаемым в крови и органах в обеих группах времени добавления на протяжении всего периода наблюдения. Чтобы предоставить доказательства инфицирования животных в группах лечения Т-705, развитие CCHFV-специфических антител измеряли 21 день p.i. Только 1/10 (10%) животных, получавших лечение после контакта, но 10/10 (100%) животных, получавших лечение с 1-го дня или 2 p.i. выработали антитела, что указывает на то, что репликации вируса при постэкспозиционной обработке Т-705 было недостаточно даже для выработки антител.

Чтобы определить наименьшую эффективную дозу Т-705, животные получали 30, 15 или 7,5 мг / (кг × сут) Т-705 или 0,5% метилцеллюлозы в качестве плацебо (рис. 7). Лечение было начато через 1 час. и продолжали до смерти или до 8-го дня. Все животные из групп, получавших 30 и 15 мг / (кг × день), выжили и почти не проявляли никаких признаков заболевания. Вирус был обнаружен на низком уровне только в крови одного животного из группы, получавшей 15 мг / (кг × сут), на 11 день (фиг. 7). Доза 7,5 мг / (кг × сут) не предотвратила летального исхода, хотя и увеличила время до смерти (p = 0.0007) и снижал уровни AST (p = 0,0007) и ALT (p = 0,004) на 3-й день. Вместе взятые, T-705 высокоэффективен против CCHFV в мышиной модели IFNAR ^{— / —} .

Рисунок 7. Определение наименьшей эффективной дозы Т-705.

Мышей инокулировали i.p. с 100 FFU вируса. Т-705 вводили перорально дважды в день с помощью желудочного зонда. Животные получали дозу Т-705 30, 15 или 7,5 мг / (кг × сут) или 0,5% метилцеллюлозы в качестве плацебо. Лечение начато 1 ч. Р.я. и продолжали до смерти или до 8-го дня. Титр вируса в органах определяли у животных, которые умерли от инфекции, и у 3 животных из группы 30 мг / (кг × сут), которых умерщвляли на 3-й день. Анализ органов не проводился на группа 15 мг / (кг × сут) (nd). Среднее и стандартное отклонение (или диапазон для n = 2) показаны для веса, температуры и логарифмически преобразованных титров органов. Вертикальные полосы на графиках для AST и ALT (обратите внимание на логарифмическую шкалу оси Y) и логарифмически преобразованные титры вирусов в крови представляют собой средние значения.Продолжительность лечения на графиках выживаемости, диапазон виремии ниже предела обнаружения иммунофокусного анализа, а также нормальный референсный диапазон АСТ и АЛТ у мышей [59] заштрихованы серым цветом. Ноты. Группа плацебо: животное, которое умерло на 5-й день, не показало повышения AST / ALT и виремии на 3-й день. 7,5 мг / (кг × день) Группа T-705: выжившее животное не показало ни повышения AST / ALT, ни виремии. время.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002804.g007

Комбинация рибавирина и Т-705

in vitro и in vivo

Рибавирин в настоящее время используется в клинических условиях для лечения хронической сердечной недостаточности [16] — [19].Поэтому важно знать, можно ли назначать Т-705 в комбинации с рибавирином и как оба препарата взаимодействуют. Сначала в культуре клеток определяли противовирусную активность 64 комбинаций рибавирина и Т-705. Матрица концентраций 8 × 8 была разработана на основе значений IC ₉₀ для обоих препаратов, как определено выше. Частицы инфекционного вируса измеряли через 3 дня p.i. с помощью иммунофокусного анализа и жизнеспособность клеток определяли методом МТТ. Поверхность доза-ответ демонстрирует, что комбинации рибавирина и Т-705 проявляют сильные противовирусные эффекты с подавлением репликации вируса более чем на 5 логарифмических единиц (рис.8А). Возможные антагонистические или синергетические эффекты оценивались с использованием модели независимости Bliss по аналогии с алгоритмами программы MacSynergy II [44], [45]. Этот анализ выявил явные синергетические эффекты, когда лекарства были объединены в концентрациях, близких к их IC ₉₀ . В этой области матрицы экспериментальный титр вируса был на 2 логарифмических единицы ниже, чем титр, предсказанный в соответствии с моделью независимости Блисса для аддитивного эффекта (фиг. 8B). МТТ-тест не выявил токсичности препарата по всей матрице (рис.8Б).

Рисунок 8. Тестирование противовирусной активности комбинации рибавирина и Т-705 в культуре клеток.

Клетки Vero E6 инокулировали CCHFV с MOI 0,01 и добавляли соединения. Матрица комбинации лекарств 1 × 8 была разработана, как описано в разделе «Материалы и методы». Концентрацию инфекционных вирусных частиц в супернатанте клеточной культуры измеряли через 3 дня p.i. иммунофокусом. Рост и жизнеспособность клеток при обработке соединения определяли методом МТТ.(A) Поверхность «доза-реакция» для комбинации рибавирина и Т-705. Сигмоидальные кривые доза-ответ были подогнаны к данным для одного лекарства, и значения IC ₅₀ и IC ₉₀ для рибавирина и Т-705 были рассчитаны на основе функций. (B) По аналогии с программой MacSynergy II [44], [45], трехмерный подход использовался для определения областей, в которых наблюдаемые эффекты больше (синергия) или меньше (антагонизм), чем предсказано моделью независимости Блисса. С этой целью соотношение между предсказанным титром вируса и наблюдаемым титром вируса было рассчитано для каждой комбинации лекарственных средств.Отношение> 1 указывает на синергию (т. Е. Титр вируса, предсказанный для аддитивного эффекта, выше, чем титр вируса, определенный экспериментально), отношение <1 указывает на антагонизм (т. Е. Титр вируса для предсказанного аддитивного эффекта ниже, чем титр вируса, определенный экспериментально) . Комбинации лекарств, показывающие явное различие между экспериментальным и прогнозируемым титром (≥4-кратное), отмечены желтым цветом, а соотношение указано красным. Значения МТТ показаны синим цветом для каждой комбинации препаратов.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pntd.0002804.g008

Для тестирования эффектов комбинации препаратов in vivo животные получали дозу Т-705 30 или 7,5 мг / (кг × сут) в комбинации с дозой рибавирина 100 мг / (кг × сут). Доза Т-705 30 мг / (кг × сут), которая является защитной при введении одного лекарственного средства, была выбрана для проверки того, влияет ли добавление рибавирина на эффективность Т-705. Чтобы выяснить, может ли комбинация двух малоэффективных доз привести к эффективному лечению, одновременно вводили 7,5 мг / (кг × сутки) Т-705 и 100 мг / (кг × сутки) рибавирина.Ни один из параметров в группе 30 мг / (кг × сутки) Т-705 плюс 100 мг / (кг × сутки) рибавирина (рис.9, слева) не отличался статистически значимо от параметров группы 30 мг / (кг × сутки). г) Группа монотерапии Т-705 (рис. 7). С другой стороны, комбинация дозы 7,5 мг / (кг × сутки) Т-705 с дозой рибавирина 100 мг / (кг × сутки) (рис.9 справа) улучшила выживаемость по сравнению с монотерапией. лечения (рис. 5 и 7), хотя увеличение не достигло статистической значимости (p = 0,08 для T-705 + рибавирин vs.Только Т-705 и p = 0,07 для Т-705 + рибавирин по сравнению с одним рибавирином; двусторонний точный тест Фишера). В заключение, Т-705 и рибавирин оказывают синергетическое действие в соответствии с моделью независимости Блисса при объединении в концентрациях, близких к их IC ₉₀ in vitro . Совместное введение обоих препаратов на животной модели предполагает, что комбинированное лечение дает скорее положительные, чем побочные эффекты.

Рисунок 9. Лечение мышей комбинацией рибавирина и Т-705.

Мышей инокулировали i.p. с 100 FFU вируса. Т-705 вводили перорально дважды в день с помощью желудочного зонда. Рибавирин вводили внутрибрюшинно. раз в день. Животные получали дозу Т-705 30 или 7,5 мг / (кг × сутки) в сочетании с дозой рибавирина 100 мг / (кг × сутки). Контрольные группы плацебо показаны на рис. 7, поскольку оба эксперимента проводились параллельно. Лечение было начато через 1 час. и продолжалось до смерти или 8-го дня. Для веса и температуры показаны среднее и стандартное отклонение.Вертикальные полосы на графиках для AST и ALT (обратите внимание на логарифмическую шкалу оси Y) и логарифмически преобразованные титры вирусов в крови представляют собой средние значения. Продолжительность лечения на графиках выживаемости, диапазон виремии ниже предела обнаружения иммунофокусного анализа, а также нормальный референсный диапазон АСТ и АЛТ у мышей [59] заштрихованы серым цветом. Ноты. У двух животных, умерших на 6-й день, не было обнаруживаемого вируса в органах или крови и не было повышения уровня АСТ / АЛТ.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pntd.0002804.g009

Обсуждение

В этом исследовании мы использовали IFNAR ^{— / —} мышей в качестве модели in vivo для оценки эффективности противовирусных препаратов против CCHFV. Основным патологическим изменением у мышей, инфицированных недавно выделенным штаммом CCHFV Afg09-2990, был острый гепатит с обширным некрозом, реактивной пролиферацией гепатоцитов, легкой или умеренной воспалительной реакцией и морфологическими признаками активации моноцитов / макрофагов.В некротических областях были обнаружены гепатоциты, инфицированные CCHFV и апоптозные. Рибавирин, арбидола гидрохлорид и Т-705 были активны против CCHFV Afg09-2990 в культуре клеток. Однако гидрохлорид арбидола был неактивным in vivo . Рибавирин был частично активен, тогда как Т-705 был высокоэффективным на мышиной модели. Последний препарат был эффективен, даже если окно для терапевтического вмешательства составляло менее 2 дней.

В прошлом были описаны три мышиные модели CCHF: модель новорожденных мышей, мыши STAT1 ^{— / —} и мыши IFNAR ^{— / —} [9] — [12].Последние модели используют дефект врожденного иммунного ответа, который, по-видимому, необходим для защиты мышей от продуктивной инфекции CCHFV. Во всех трех моделях мыши умирают от инфекции в течение нескольких дней. Мы предпочитаем работать с мышами IFNAR ^{— / —} , поскольку генетический дефект касается только передачи сигналов интерферона I типа, в то время как дефицит STAT1 предотвращает активацию генов из-за сигнала интерферонов I или II типа, а новорожденные мыши иммунологически иммунны. толерантный (неонатальная толерантность).Мыши IFNAR ^{— / —} очень восприимчивы к инфекции CCHFV. Посевной материал, достаточный для инициации продуктивной инфекции, очень низкий — 0,3 FFU, что предположительно соответствует всего нескольким инфекционным вирусным частицам. Это согласуется с экспериментами на мышах AG129, лишенных рецепторов интерферона типа I и типа II, в которых инокулята 0,1 БОЕ вируса лимфоцитарного хориоменингита было достаточно для заражения животных [49].

Совсем недавно было показано, что модель IFNAR ^{— / —} имитирует признаки заболевания CCHF человека [12].Эти результаты расширены здесь более подробным иммуногистопатологическим анализом печени. Гистопатология, измерение вирусной нагрузки, окрашивание антигенов в различных органах и измерение AST и ALT демонстрируют, что печень является основным органом-мишенью CCHFV. Хотя вирус был обнаружен во всех органах, его титр в печени самый высокий и в некоторых экспериментах превышает 7 log ₁₀ FFU / g. Более высокий титр вируса в печени по сравнению с другими органами может объяснить, почему анализ ИГХ на вирусный антиген выявил четко положительные клетки только в печени, в то время как сигналы в других органах были слабыми или отсутствовали.В исключительных случаях значения АСТ и АЛТ достигали 10 000 Ед / л и 1000 Ед / л соответственно, что свидетельствует о массивном повреждении клеток печени. Однако, хотя АЛТ специфичен для этого органа, АСТ также присутствует на высоком уровне в сердце, скелетных мышцах, почках, головном мозге и эритроцитах [50]. Следовательно, высокое соотношение AST / ALT также может указывать на повреждение внепеченочных клеток. В целом, гистологические и биохимические данные совместимы с диагнозом молниеносного поражения печени. Наши результаты также согласуются с патологическими наблюдениями при CCHF человека; гепатоцеллюлярный некроз с гиперпластическими и гипертрофическими клетками Купфера и легкими или отсутствующими воспалительными клеточными инфильтратами является выдающейся гистопатологической находкой у людей [3].Заслуживают внимания два новых аспекта, которые могут дать некоторые ключи к разгадке патофизиологии CCHF. Во-первых, в некротических поражениях печени скопились как гепатоциты, инфицированные CCHFV, так и апоптотические гепатоциты. Это может указывать на то, что клетки, инфицированные CCHFV, подвергаются апоптозу и некрозу. Поскольку воспалительная реакция была от легкой до умеренной, прямое цитопатическое действие вируса на гепатоциты может быть связано с индукцией апоптоза и некроза. Важно отметить, что эта гипотеза была выдвинута в ранних исследованиях ИГХ на людях с CCHF [3].Во-вторых, в печени были обнаружены активированные Iba-1-положительные макрофаги и активированные клетки, происходящие из моноцитов, экспрессирующие iNOS. Эти клетки могут играть решающую роль в сильных провоспалительных иммунных ответах после инфекции CCHFV, о чем свидетельствует значительное увеличение сывороточных провоспалительных цитокинов и молекул хемоаттрактантов у мышей IFNAR ^{— / —} и STAT1 ^{— / —} , а также у людей. [6] — [8], [10], [12].

В этом исследовании мы использовали модель мыши IFNAR ^{— / —} для тестирования противовирусных препаратов против CCHFV in vivo .Рибавирин является стандартным лечением при ГКГН человека, хотя его клиническая эффективность не доказана [16] — [19] — и показывает положительные эффекты на неонатальных моделях и моделях мышей STAT1 ^{— / —} [9], [10]. Поэтому мы сначала оценили модель мыши IFNAR ^{— / —} с использованием этого препарата. Время выживания было увеличено, при этом выживаемость не увеличилась, что в значительной степени соответствует результатам экспериментов по заражению высокими дозами на мышах STAT1 ^{— / —} [10]. Несмотря на задержку прогрессирования заболевания и снижение вирусной нагрузки в крови и органах, о чем свидетельствуют титрование вируса и ИГХ, рибавирин не смог предотвратить летальный патофизиологический каскад.Важно отметить, что развитие терминального некроза печени с заметной активацией моноцитов / макрофагов при фактическом отсутствии вируса в органе демонстрирует, что пути хозяина, когда они запускаются вирусом, опосредуют патологию и смерть независимо от наличия триггера.

Вторым испытанным соединением был арбидол гидрохлорид, противовирусный препарат широкого спектра действия, применяемый в клинической практике против гриппа [20] — [24]. Арбидола гидрохлорид эффективно подавлял CCHFV в культуре клеток. Однако никаких положительных эффектов на мышиной модели IFNAR ^{— / —} не наблюдалось.Препарат вводили тем же путем, но в более высоких дозах, чем в предыдущих исследованиях, которые показали положительный эффект против гриппа A, вируса Коксаки B и хантаана у мышей [20], [22]. Соединение обладало значительной токсичностью при более высоких концентрациях в культуре клеток. Возможно, что его противовирусный эффект in vitro , по крайней мере, частично объясняется общеклеточными токсическими эффектами, которые не обнаруживаются в анализе МТТ, используемом для оценки жизнеспособности клеток. Следовательно, возможно, что данные in vitro переоценивают истинный противовирусный эффект препарата против CCHFV.Кроме того, арбидол чрезвычайно гидрофобен, что может снизить его пероральную биодоступность у мышей. Возможно, в будущем стоит испытать арбидол в составе фармацевтических препаратов с повышенной растворимостью [51].

Важным наблюдением в нашем исследовании является сильное противовирусное действие Т-705 против CCHFV в культуре клеток и на мышиной модели IFNAR ^{— / —} . Было показано, что это соединение высокоактивно против ряда вирусов in vitro и in vivo , включая ортомиксовирусы, аренавирусы и буньявирусы родов hantavirus и phlebovirus [28] — [34].Следовательно, его активность против CCHFV, буньявируса из рода nairovirus , не является неожиданной. Однако ввиду низкой или недостаточной активности рибавирина и арбидола in vivo — оба из которых имеют почти такие же значения IC ₅₀ и IC ₉₀ , чем T-705, — высокая активность in vivo T -705 удивительно. IC ₅₀ для CCHFV в 5–30 раз ниже, чем значения IC ₅₀ для других буньявирусов [35], что может указывать на особую чувствительность этого вируса к T-705.Даже если его вводили за 2 дня до предполагаемого времени смерти, животные выживали и почти не проявляли признаков болезни. Если препарат вводится сразу после контакта, он подавляет репликацию вируса ниже уровня, необходимого для выработки антител. Мы могли снизить дозу в 20 раз [с 300 до 15 мг / (кг × сут)], при этом лекарство все еще показывало эффективность после воздействия.

Механизм действия Т-705 против CCHFV неизвестен. По аналогии с другими сегментированными вирусами с отрицательной цепью, Т-705-рибофуранозил-5′-трифосфат может быть включен в формирующуюся цепь РНК и ингибировать дальнейшее удлинение цепи или вызвать летальный мутагенез [36] — [40].Как рибавирин действует против CCHFV, до сих пор не известно, хотя препарат используется в клинической практике уже несколько десятилетий. Для других вирусов было предложено несколько механизмов: он может быть включен в вирусную РНК, вызывая летальный мутагенез [52], препятствовать кэппированию [53], ингибировать вирусную РНК-полимеразу [54], [55] или ингибировать фермент клетки-хозяина инозин. монофосфатдегидрогеназа (IMPDH) приводит к снижению уровня GTP [56] — [58]. T-705-рибофуранозил-5′-монофосфат был в 150 раз слабее рибавирин-5′-монофосфата по своему ингибирующему эффекту IMPDH, что позволяет предположить, что IMPDH не является основным ферментом-мишенью для T-705 [39], [40].Учитывая, что механизм действия обоих препаратов плохо изучен, трудно предсказать, как они взаимодействуют. Однако, поскольку рибавирин является стандартным препаратом для лечения CCHF [16] — [19], комбинированное лечение рибавирин / T-705 было бы очевидным вариантом в клинической практике. Наши эксперименты предполагают, что оба препарата не действуют антагонистически in vitro и in vivo . Согласно модели независимости Блисса есть даже доказательства синергического взаимодействия in vitro , а эксперименты на модели животных указывают на благоприятное, а не на неблагоприятное взаимодействие in vivo .В заключение, наши данные обещают клиническую эффективность комбинированного лечения Т-705 или рибавирин / Т-705 при ГКГН человека.

Благодарности

Авторы благодарят Cesar Munoz-Fontela за плодотворные обсуждения. Отделение вирусологии Института Бернхарда-Нохта является центром сотрудничества ВОЗ по справочным материалам и исследованиям по арбовирусам и геморрагической лихорадке (DEU-115).

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: LO TR XdL SÖ SG.Проведены эксперименты: LO TR MN ML SK SW SÖ. Проанализированы данные: LO TR MN CB ML SK SÖ SG. Внесенные реагенты / материалы / инструменты анализа: PE. Написал статью: LO TR MN CB SÖ SG.

Ссылки

1. 1.
   Joubert JR, King JB, Rossouw DJ, Cooper R (1985) Нозокомиальная вспышка крымско-конголезской геморрагической лихорадки в больнице Tygerberg. Часть III. Клиническая патология и патогенез. S Afr Med J 68: 722–728.
2. 2.
   Свейнпол Р., Гилл Д.Е., Шеперд А.Дж., Леман П.А., Минхардт Дж. Х. и др.(1989) Клиническая патология Крымско-Конго геморрагической лихорадки. Rev Infect Dis 11 Suppl 4: S794–800.
3. 3.
   Берт Ф.Дж., Свейнпол Р., Шие В.Дж., Смит Дж.Ф., Леман П.А. и др. (1997) Иммуногистохимическая локализация и локализация in situ вируса Крымско-Конго геморрагической лихорадки (CCHF) в тканях человека и значение для патогенеза CCHF. Arch Pathol Lab Med 121: 839–846.
4. 4.
   Whitehouse CA (2004) Крымско-конголезская геморрагическая лихорадка. Antiviral Res 64: 145–160.
5. 5.Эргонул О. (2006) Крымско-Конго геморрагическая лихорадка. Lancet Infect Dis 6: 203–214.
6. 6.
   Ergonul O, Tuncbilek S, Baykam N, Celikbas A, Dokuzoguz B (2006) Оценка сывороточных уровней интерлейкина (IL) -6, IL-10 и фактора некроза опухоли альфа у пациентов с Крымско-Конго геморрагической лихорадкой. J Infect Dis 193: 941–944.
7. 7.
   Саксида А., Дух Д., Врабер Б., Дедушадж И., Ахмети С. и др. (2010) Взаимодействие иммунных механизмов и вирусной нагрузки в патогенезе крымско-конго геморрагической лихорадки.Clin Vaccine Immunol 17: 1086–1093.
8. 8.
   Папа А., Бино С., Вело Э, Харкси А., Кота М. и др. (2006) Уровни цитокинов при Крымско-Конго геморрагической лихорадке. J Clin Virol 36: 272–276.
9. 9.
   Tignor GH, Hanham CA (1993) Эффективность рибавирина в модели инфекции вирусом крымско-конголезской геморрагической лихорадки (CCHF) in vivo. Antiviral Res 22: 309–325.
10. 10.
    Бенте Д.А., Алимонти Дж. Б., Шие В. Дж., Камю Дж., Штрохер У. и др. (2010) Патогенез и иммунный ответ вируса Крымско-Конго геморрагической лихорадки на модели мышей с нокаутом STAT-1.J Virol 84: 11089–11100.
11. 11.
    Bereczky S, Lindegren G, Karlberg H, Akerstrom S, Klingstrom J, et al. (2010) Инфекция, вызванная вирусом крымско-конголезской геморрагической лихорадки, смертельна для взрослых мышей с нокаутом рецепторов интерферона I типа. J Gen Virol 91: 1473–1477.
12. 12.
    Зивчек М., Сафронец Д., Скотт Д., Робертсон С., Эбихара Н. и др. (2013) Смертельная инфекция вируса крымско-конголезской геморрагической лихорадки у мышей с нокаутом по рецепторам интерферона альфа / бета связана с высокой вирусной нагрузкой, провоспалительными реакциями и коагулопатией.J Infect Dis 207: 1909–1921.
13. 13.
    Boyd A, Fazakerley JK, Bridgen A (2006) Патогенез инфекции вирусом Дугбе у мышей дикого типа и мышей с дефицитом интерферона. J Gen Virol 87: 2005–2009.
14. 14.
    Доуэлл С.Д., Финдли-Уилсон С., Рейнер Э., Пирсон Г., Пикерсгилл Дж. И др. (2012) Инфекция вирусом Хазара является смертельной для взрослых мышей с нокаутом рецепторов интерферона I типа и может выступать в качестве суррогата инфекции, вызываемой патогенным для человека вирусом крымско-конголезской геморрагической лихорадки.J Gen Virol 93: 560–564.
15. 15.
    Watts DM, Ussery MA, Nash D, Peters CJ (1989) Ингибирование вирусной инфекционности крымско-конголезской геморрагической лихорадки дает in vitro рибавирин. Am J Trop Med Hyg 41: 581–585.
16. 16.
    Фишер-Хох С.П., Хан Дж.А., Рехман С., Мирза С., Хуршид М. и др. (1995) Крымская конго-геморрагическая лихорадка, леченная пероральным рибавирином. Ланцет 346: 472–475.
17. 17.
    Элалди Н., Бодур Х., Ачиоглу С., Челикбас А., Озкурт З. и др. (2009) Эффективность перорального лечения рибавирином при Крымско-Конго геморрагической лихорадке: квазиэкспериментальное исследование, проведенное в Турции.J Заражение 58: 238–244.
18. 18.
    Ascioglu S, Leblebicioglu H, Vahaboglu H, Chan KA (2011) Рибавирин для пациентов с Крымско-Конго геморрагической лихорадкой: систематический обзор и метаанализ. J Antimicrob Chemother 66: 1215–1222.
19. 19.
    Дуйгу Ф., Кая Т., Байсан П. (2012) Переоценка 400 случаев крымско-конголезской геморрагической лихорадки в эндемичной зоне: подходит ли лечение рибавирином? Переносимые переносчиками зоонозы Dis 12: 812–816.
20. 20.
    Shi L, Xiong H, He J, Deng H, Li Q и др.(2007) Противовирусная активность арбидола против вируса гриппа A, респираторно-синцитиального вируса, риновируса, вируса Коксаки и аденовируса in vitro и in vivo. Arch Virol 152: 1447–1455.
21. 21.
    Чжун Кью, Ян З., Лю И, Дэн Х, Сяо Х и др. (2009) Противовирусная активность арбидола против вируса Коксаки B5 in vitro и in vivo. Arch Virol 154: 601–607.
22. 22.
    Deng HY, Luo F, Shi LQ, Zhong Q, Liu YJ и др. (2009) Эффективность арбидола в отношении летальных инфекций вируса Хантаана у мышей-сосунков и in vitro.Acta Pharmacol Sin 30: 1015–1024.
23. 23.
    Delogu I, Pastorino B, Baronti C, Nougairede A, Bonnet E и др. (2011) Противовирусная активность арбидола против вируса чикунгунья in vitro и характеристики выбранного устойчивого мутанта. Antiviral Res 90: 99–107.
24. 24.
    Брукс М.Дж., Бурцева Е.И., Эллери П.Дж., Марш Г.А., Лью А.М. и др. (2012) Противовирусная активность арбидола, препарата широкого спектра действия против респираторных вирусов, варьируется в зависимости от условий испытаний.J Med Virol 84: 170–181.
25. 25.
    Борискин Ю.С., Ленева И.А., Печер Е.И., Поляк С.Ю. (2008) Арбидол: противовирусное соединение широкого спектра действия, блокирующее слияние вирусов. Curr Med Chem 15: 997–1005.
26. 26.
    Ленева И.А., Рассел Р.Дж., Борискин Ю.С., Хэй А.Дж. (2009) Характеристики устойчивых к арбидолу мутантов вируса гриппа: значение для механизма противогриппозного действия арбидола. Противовирусный Res 81: 132–140.
27. 27.
    Teissier E, Zandomeneghi G, Loquet A, Lavillette D, Lavergne JP, et al.(2011) Механизм ингибирования слияния оболочечной вирусной мембраны противовирусным препаратом арбидол. PLoS One 6: e15874.
28. 28.
    Фурута Ю., Такахаши К., Фукуда Ю., Куно М., Камияма Т. и др. (2002) Активность соединения Т-705 против вируса гриппа in vitro и in vivo. Антимикробные агенты Chemother 46: 977–981.
29. 29.
    Гоуэн Б. Б., Вонг М. Х., Юнг К. Х., Сандерс А. Б., Менденхолл М. и др. (2007) Активность Т-705 in vitro и in vivo против аренавирусных и буньявирусных инфекций.Антимикробные агенты Chemother 51: 3168–3176.
30. 30.
    Gowen BB, Smee DF, Wong MH, Hall JO, Jung KH и др. (2008) Лечение поздней стадии заболевания на модели аренавирусной геморрагической лихорадки: эффективность и снижение токсичности Т-705 предлагает альтернативу рибавирину. PLoS One 3: e3725.
31. 31.
    Кисо М., Такахаши К., Сакаи-Тагава Ю., Шинья К., Сакабе С. и др. (2010) Активность Т-705 (фавипиравира) против летальных вирусов гриппа A H5N1. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 882–887.
32. 32.
    Гоуэн Б. Б., Вонг М. Х., Юнг К. Х., Сми Д. Ф., Морри Д. Д. и др. (2010) Эффективность фавипиравира (Т-705) и производных пиразина Т-1106 на моделях флебовирусных заболеваний. Antiviral Res 86: 121–127.
33. 33.
    Менденхолл М., Рассел А., Сми Д.Ф., Холл Дж. О., Скирпстунас Р. и др. (2011) Эффективная пероральная терапия фавипиравиром (Т-705), начатая после начала клинического заболевания на модели аренавирусной геморрагической лихорадки. PLoS Negl Trop Dis 5: e1342.
34. 34.
    Safronetz D, Falzarano D, Scott DP, Furuta Y, Feldmann H, et al.(2013) Противовирусная эффективность фавипиравира против двух известных этиологических агентов хантавирусного легочного синдрома. Антимикробные агенты Chemother 57: 4673–4680.
35. 35.
    Furuta Y, Gowen BB, Takahashi K, Shiraki K, Smee DF и др. (2013) Фавипиравир (Т-705), новый ингибитор вирусной РНК-полимеразы. Antiviral Res 100: 446–454.
36. 36.
    Баранович Т., Вонг С.С., Армстронг Дж., Марджуки Х., Уэбби Р.Дж. и др. (2013) T-705 (фавипиравир) индуцирует летальный мутагенез вирусов гриппа A h2N1 in vitro.J Virol 87: 3741–3751.
37. 37.
    Джин З., Смит Л.К., Раджванши В.К., Ким Б., Деваль Дж. (2013) Неоднозначное спаривание оснований и высокая субстратная эффективность рибофуранозил-5′-трифосфата Т-705 (фавипиравира) по отношению к полимеразе вируса гриппа А. PLoS One 8: e68347.
38. 38.
    Naesens L, Guddat LW, Keough DT, van Kuilenburg AB, Meijer J, et al. (2013) Роль гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы человека в активации противовирусного агента Т-705 (фавипиравир). Mol Pharmacol 84: 615–629.
39. 39.
    Сми Д.Ф., Херст Б.Л., Эгава Х., Такахаши К., Кадота Т. и др. (2009) Внутриклеточный метаболизм фавипиравира (T-705) в неинфицированных и инфицированных вирусом гриппа A (H5N1) клетках. J Antimicrob Chemother 64: 741–746.
40. 40.
    Фурута Ю., Такахаши К., Куно-Маекава М., Сангава Х., Уехара С. и др. (2005) Механизм действия Т-705 против вируса гриппа. Антимикробные агенты Chemother 49: 981–986.
41. 41.
    Килкенни С., Браун В.Дж., Катхилл И.К., Эмерсон М., Альтман Д.Г. (2010) Улучшение отчетности по бионаучным исследованиям: рекомендации ARRIVE по отчетности об исследованиях на животных.PLoS Biol 8: e1000412.
42. 42.
    Ölschläger S, Gabriel M, Schmidt-Chanasit J, Meyer M, Osborn E, et al. (2011) Полная последовательность и филогенетическая характеристика вируса Крымско-Конго геморрагической лихорадки из Афганистана. J Clin Virol 50: 90–92.
43. 43.
    Günther S, Asper M, Roser C, Luna LK, Drosten C и др. (2004) Применение ПЦР в реальном времени для тестирования антивирусных соединений против вируса Ласса, коронавируса SARS и вируса Эбола in vitro. Antiviral Res 63: 209–215.
44. 44.
    Greco WR, Bravo G, Parsons JC (1995) Поиск синергизма: критический обзор с точки зрения поверхности отклика. Pharmacol Rev 47: 331–385.
45. 45.
    Причард М.Н., Шипман С.-младший (1990) Трехмерная модель для анализа лекарственного взаимодействия. Antiviral Res 14: 181–205.
46. 46.
    Muller U, Steinhoff U, Reis LF, Hemmi S, Pavlovic J, et al. (1994) Функциональная роль интерферонов типа I и типа II в противовирусной защите. Наука 264: 1918–1921.
47. 47.
    Sidwell RW, Bailey KW, Wong MH, Barnard DL, Smee DF (2005) Эффекты вирамидина, ингибирующие вирус гриппа in vitro и in vivo. Противовирусный Res 68: 10–17.
48. 48.
    Эммерих П., Авшич-Зупанк Т., Чиникар С., Саксида А., Том-Болдуан С. и др. (2010) Ранняя серодиагностика острых вирусных инфекций Крымско-Конго геморрагической лихорадки человека с помощью новых методов захвата. Дж. Клин Вирол 48: 294–295.
49. 49.
    Ciurea A, Klenerman P, Hunziker L, Horvath E, Odermatt B и др.(1999) Персистенция вируса лимфоцитарного хориоменингита на очень низких уровнях у иммунных мышей. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 11964–11969.
50. 50.
    Джаннини EG, Testa R, Savarino V (2005) Изменение ферментов печени: руководство для клиницистов. Cmaj 172: 367–379.
51. 51.
    Еропкин М.Ю., Соловский М.В., Смирнова М.Ю., Брязжикова Т.С., Гудкова Т.М. и др. (2009) Синтез и биологическая активность водорастворимых полимерных комплексов арбидола. Pharm Chem J 43: 563–567.
52. 52.Кротти С., Мааг Д., Арнольд Дж. Дж., Чжун В., Лау Дж. Й. и др. (2000) Противовирусный рибонуклеозид рибавирин широкого спектра действия представляет собой мутаген РНК вируса. Нат Мед 6: 1375–1379.
53. 53.
    Goswami BB, Borek E, Sharma OK, Fujitaki J, Smith RA (1979) Противовирусный агент широкого спектра действия рибавирин ингибирует кэппирование мРНК. Biochem Biophys Res. Commun. 89: 830–836.
54. 54.
    Эрикссон Б., Хельгстранд Э., Йоханссон Н.Г., Ларссон А., Мисиорни А. и др. (1977) Ингибирование полимеразы рибонуклеиновой кислоты вируса гриппа рибавиринтрифосфатом.Антимикробные агенты Chemother 11: 946–951.
55. 55.
    Fernandez-Larsson R, O’Connell K, Koumans E, Patterson JL (1989) Молекулярный анализ ингибирующего действия фосфорилированного рибавирина на полимеразную реакцию in vitro вируса везикулярного стоматита. Антимикробные агенты Chemother 33: 1668–1673.
56. 56.
    Стритер Д.Г., Витковски Д.Т., Харе Г.П., Сидвелл Р.В., Бауэр Р.Дж. и др. (1973) Механизм действия 1-бета-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида (виразол), нового противовирусного агента широкого спектра действия.Proc Natl Acad Sci U S A 70: 1174–1178.
57. 57.
    Leyssen P, Balzarini J, De Clercq E, Neyts J (2005) Преобладающий механизм, с помощью которого рибавирин проявляет свою противовирусную активность in vitro против флавивирусов и парамиксовирусов, опосредуется ингибированием дегидрогеназы IMP. J Virol 79: 1943–1947.
58. 58.
    Smee DF, Bray M, Huggins JW (2001) Исследования противовирусной активности и механизма действия рибавирина и микофеноловой кислоты против ортопоксвирусов in vitro. Antivir Chem Chemother 12: 327–335.
59. 59.
    Zhou X, Hansson GK (2004) Влияние пола и возраста на биохимические контрольные диапазоны сыворотки у мышей C57BL / 6J. Comp Med 54: 176–178.

Поисковое рандомизированное контролируемое исследование эффективности и безопасности лопинавира / ритонавира или арбидола у взрослых пациентов, госпитализированных с COVID-19 легкой / умеренной степени тяжести (ELACOI)

% PDF-1.7
%
1 0 объект
> / Метаданные 4 0 R / Страницы 2 0 R / StructTreeRoot 3 0 R / Тип / Каталог / Viewer Настройки 5 0 R >>
эндобдж
4 0 obj
> поток
Приложение Microsoft® Word 2019 / pdf

Microsoft® Word 20192020-03-19T23: 16: 02 + 08: 002021-03-30T02: 46: 21-07: 002021-03-30T02: 46: 21-07: 00uuid: A11438D8-3F09-4E12-AA00-22CDA82F3897uuid : 10318b9d-1dd2-11b2-0a00-d30000000000
конечный поток
эндобдж
2 0 obj
>
эндобдж
3 0 obj
>
эндобдж
5 0 obj
>
эндобдж
38 0 объект
>
эндобдж
39 0 объект
>
эндобдж
199 0 объект
[549 0 R 550 0 R 551 0 R 552 0 R 553 0 R 554 0 R 555 0 R 556 0 R 557 0 R 558 0 R 559 0 R 560 0 R 561 0 R 562 0 R 563 0 R 564 0 R 565 0 566 р. 567 0 р. 568 0 р. 569 0 р. 570 0 р. 571 0 р. 572 0 р. 573 0 р. 574 0 р. 575 0 ран.
эндобдж
200 0 объект
[579 0 R 580 0 R 581 0 R 582 0 R 583 0 R 584 0 R 585 0 R 586 0 R 587 0 R 588 0 R 589 0 R 590 0 R 591 0 R 592 0 R 593 0 R 594 0 R 595 0 R 596 0 R 597 0 R 598 0 R 599 0 R 600 0 R 601 0 R 602 0 R 603 0 R 604 0 R 605 0 R 606 0 R 607 0 R 608 0 R 609 0 R 610 0 R 611 0 R 612 0 R 613 0 R 614 0 R 615 0 R 616 0 R 617 0 R 618 0 R 619 0 R 620 0 R 621 0 R 622 0 R 623 0 R 624 0 R 625 0 R 626 0 R 627 0 R 628 0 629 0 R 630 0 R 631 0 R 632 0 R 466 0 R 633 0 R 634 0 R 635 0 R 468 0 R 636 0 R 637 0 R 638 0 R 470 0 R 639 0 R 640 0 R 641 0 R 472 0 R 642 0 R 643 0 R 644 0 R 474 0 R 475 0 R 236 0 R 645 0 R 646 0 R 647 0 R 648 0 R 649 0 R 650 0 R 651 0 R 652 0 R 237 0 R 653 0 R 654 0 R 655 0 R 656 0 R 657 0 R 658 0 R 659 0 R 660 0 R 661 0 R]
эндобдж
201 0 объект
[662 0 R 663 0 R 664 0 R 665 0 R 666 0 R 667 0 R 668 0 R 669 0 R 670 0 R 671 0 R 672 0 R 673 0 R 674 0 R 675 0 R 676 0 R 677 0 R 678 0 679 р. 680 0 р. 681 0 р. 682 0 р. 683 0 р. 684 0 р. 685 0 р. 686 0 р. 687 0 р. 688 0 р. 689 0 р.]
эндобдж
202 0 объект
>
эндобдж
203 0 объект
[691 0 R 692 0 R 693 0 R 694 0 R 695 0 R 696 0 R 697 0 R 698 0 R 270 0 R]
эндобдж
204 0 объект
[699 0 R 700 0 R 701 0 R 702 0 R 703 0 R 704 0 R 705 0 R 706 0 R 707 0 R 708 0 R 709 0 R 710 0 R 711 0 R 712 0 R 713 0 R 714 0 R 715 0 R 716 0 R 717 0 R 718 0 R 719 0 R 720 0 R 721 0 R]
эндобдж
205 0 объект
[722 0 R 723 0 R 724 0 R 725 0 R 726 0 R 727 0 R 728 0 R 729 0 R 730 0 R 731 0 R 291 0 R]
эндобдж
206 0 объект
[732 0 R 733 0 293 0 R]
эндобдж
207 0 объект
[734 0 R 735 0 R 736 0 R 737 0 R 738 0 R 739 0 R 740 0 R 741 0 R 742 0 R 743 0 R 744 0 R 745 0 R 746 0 R 298 0 R]
эндобдж
208 0 объект
[747 0 R 748 0 300 0 R]
эндобдж
209 0 объект
[749 0 R 750 0 R 751 0 R 752 0 R 753 0 R 754 0 R 755 0 R 305 0 R]
эндобдж
210 0 объект
[756 0 R 757 0 R 758 0 R 759 0 R 760 0 R 761 0 R]
эндобдж
211 0 объект
[762 0 R 763 0 R 764 0 R 765 0 R 766 0 R 312 0 R]
эндобдж
212 0 объект
[767 0 R 768 0 R 769 0 R 770 0 R 771 0 R 772 0 R 315 0 R]
эндобдж
213 0 объект
[773 0 R 774 0 R 775 0 R 776 0 R 777 0 R 778 0 R 779 0 R 780 0 R 781 0 R 782 0 R 783 0 R 784 0 R]
эндобдж
214 0 объект
[785 0 R 786 0 R 787 0 R 788 0 R 325 0 R]
эндобдж
215 0 объект
[789 0 R 790 0 R 791 0 R 792 0 R 793 0 R 794 0 R 795 0 R 330 0 R]
эндобдж
216 0 объект
[796 0 R 797 0 R 798 0 R 799 0 R 800 0 R 801 0 R 802 0 R 335 0 R]
эндобдж
217 0 объект
[803 0 R 804 0 R 805 0 R 806 0 R 807 0 R 808 0 R 809 0 R]
эндобдж
218 0 объект
[810 0 R 811 0 R 812 0 R 813 0 R 814 0 R 815 0 R 816 0 R 344 0 R 345 0 R]
эндобдж
219 0 объект
[346 0 R]
эндобдж
220 0 объект
[817 0 R 818 0 R 819 0 R 820 0 R 821 0 R 822 0 R 823 0 R 824 0 R 825 0 R 826 0 R 827 0 R 828 0 R 829 0 R 830 0 R 831 0 R 832 0 R]
эндобдж
221 0 объект
[833 0 R 834 0 R 835 0 R 836 0 R 837 0 R 838 0 R 839 0 R 840 0 R 841 0 R 355 0 R]
эндобдж
222 0 объект
[842 0 R 843 0 R 844 0 R 845 0 R 846 0 R 847 0 R 848 0 R 849 0 R 850 0 R 851 0 R 852 0 R 853 0 R 854 0 R 855 0 R 856 0 R 857 0 R]
эндобдж
223 0 объект
[858 0 R 859 0 R 860 0 R 861 0 R 862 0 R 863 0 R 864 0 R 865 0 R 866 0 R 867 0 R 868 0 R 869 0 R 870 0 R 871 0 R 872 0 R 873 0 R 874 0 R 875 0 R 876 0 R 877 0 R 878 0 R 879 0 R 880 0 R 881 0 R 882 0 R 883 0 R 884 0 R 885 0 R 886 0 R 887 0 R 888 0 R 889 0 R 890 0 R 891 0 R 892 0 R 893 0 R 894 0 R 895 0 R 896 0 R 897 0 R 898 0 R 899 0 R 900 0 R 901 0 R 902 0 R 903 0 R 904 0 R 905 0 R 906 0 R 907 0 R 908 0 R 909 0 R 910 0 R 911 0 R 912 0 R 913 0 R 914 0 R 915 0 R 916 0 R 917 0 R 918 0 R 919 0 R 920 0 R 921 0 R 922 0 R 923 0 R]
эндобдж
224 0 объект
>
эндобдж
225 0 объект
>
эндобдж
226 0 объект
[928 0 R 929 0 R 930 0 R 931 0 R 932 0 R 933 0 R 934 0 R 935 0 R 936 0 R 937 0 R 938 0 R 939 0 R 940 0 R 941 0 R 942 0 R 943 0 R 944 0 R 945 0 R 946 0 R 947 0 R 948 0 R 949 0 R 950 0 R 951 0 R 952 0 R 953 0 R 954 0 R 955 0 R 956 0 R 957 0 R 958 0 R 959 0 R 960 0 R 961 0 R 962 0 R 963 0 R 964 0 R 965 0 R 966 0 R 967 0 R 968 0 R 969 0 R 970 0 R 971 0 R 972 0 R 973 0 R 974 0 R 975 0 R 976 0 R 977 0 978 р. 979 0 р. 980 0 р. 981 0 р. 982 0 р. 983 0 р. 984 0 р. 985 0 р. 986 0 р. 990 0 р. 991 0 р. 992 0 р. 993 0 р. 994 0 R 995 0 R 996 0 R 997 0 R 998 0 R 999 0 R 1000 0 R 1001 0 R 1002 0 R 1003 0 R 1004 0 R 1005 0 R 376 0 R]
эндобдж
227 0 объект
[1006 0 R 1007 0 R 1008 0 R 1009 0 R 1010 0 R 1011 0 R 1012 0 R 1013 0 R 1014 0 R 1015 0 R 1016 0 R 1017 0 R 1018 0 R 1019 0 R 1020 0 R 1021 0 R 1022 0 R 1023 0 R 1024 0 R 1025 0 R 1026 0 R 1027 0 R 1028 0 R 1029 0 R 1030 0 R 1031 0 R 1032 0 R 1033 0 R 1034 0 R 1035 0 R 1036 0 R 1037 0 R 1038 0 R 1039 0 R 1040 0 R 1041 0 R 1042 0 R 1043 0 R 1044 0 R 1045 0 R 1046 0 R 1047 0 R 1048 0 R 1049 0 R 1050 0 R 1051 0 R 1052 0 R 1053 0 R 1054 0 R 1055 0 R 1056 0 R 1057 0 R 1058 0 R 1059 0 R 1060 0 R 1061 0 R 1062 0 R 1063 0 R 1064 0 R 1065 0 R 1066 0 R 1067 0 R 1068 0 R 1069 0 R 1070 0 R 1071 0 R 1072 0 R 1073 0 R 1074 0 R 1075 0 R 1076 0 R 1077 0 R 1078 0 R 1079 0 R 1080 0 R 1081 0 R 1082 0 R 1083 0 R 1084 0 R 1085 0 R 1086 0 R 1087 0 R 1088 0 R 1089 0 R 1090 0 R 1091 0 R 1092 0 R 1093 0 R 1094 0 R 1095 0 R 1096 0 R 1097 0 R 1098 0 R 1099 0 R 1100 0 R 1101 0 R 1102 0 R 1103 0 R 1104 0 R 1105 0 1106 0 R 1107 0 R 1108 0 R 1109 0 R 1110 0 R 1111 0 R 1112 0 R 1113 0 R 1114 0 R 1115 0 R 1116 0 R 1117 0 R 1118 0 R 1119 0 R 1120 0 R 1121 0 R 1122 0 R 1123 0 R 1124 0 R 1125 0 R]
эндобдж
228 0 объект
[1126 0 R 1127 0 R 1128 0 R 1129 0 R 1130 0 R 1131 0 R 1132 0 R 1133 0 R 1134 0 R 1135 0 R 1136 0 R 1137 0 R 1138 0 R 1139 0 R 1140 0 R 1141 0 R 1142 0 R 1143 0 R 1144 0 R 1145 0 R 1146 0 R 1147 0 R 1148 0 R 1149 0 R 1150 0 R 1151 0 R 1152 0 R 1153 0 R 1154 0 R 1155 0 R 1156 0 R 1157 0 R 1158 0 R 1159 0 R 1160 0 R 1161 0 R 1162 0 R 1163 0 R 1164 0 R 1165 0 R 1166 0 R]
эндобдж
229 0 объект
[1167 0 R 1168 0 R 1169 0 R 1170 0 R 1171 0 R 1172 0 R 1173 0 R 1174 0 R 1175 0 R 1176 0 R 1177 0 R 1178 0 R 1179 0 R 1180 0 R 1181 0 R 1182 0 R 1183 0 R 1184 0 R 1185 0 R 1186 0 R 1187 0 R 1188 0 R 1189 0 R 1190 0 R 1191 0 R 1192 0 R 1193 0 R 1194 0 R 1195 0 R 1196 0 R 1197 0 R 1198 0 R 1199 0 R 1200 0 R 1201 0 R 1202 0 R 1203 0 R 1204 0 R 1205 0 R 1206 0 R 1207 0 R 1208 0 R 1209 0 R 1210 0 R 1211 0 R 1212 0 R 1213 0 R 1214 0 R 1215 0 R 1216 0 R 1217 0 R 1218 0 R 1219 0 R 1220 0 R 1221 0 R 1222 0 R 1223 0 R 1224 0 R 1225 0 R 1226 0 R 1227 0 R 1228 0 R 1229 0 R 1230 0 R 1231 0 R 1232 0 R 1233 0 R 1234 0 R 1235 0 R 1236 0 R 1237 0 R 1238 0 R 1239 0 R 1240 0 R 1241 0 R 1242 0 R 1243 0 R 1244 0 R 1245 0 R 1246 0 R 1247 0 R 1248 0 R 1249 0 R 1250 0 R 1251 0 R 1252 0 R 1253 0 R 1254 0 R 1255 0 R 1256 0 R 1257 0 R 1258 0 R 1259 0 R 1260 0 R 1261 0 R 1262 0 R 1263 0 R 1264 0 R 1265 0 R 1266 0 1267 0 справа 1268 0 справа 1269 0 справа 1270 0 справа 1271 0 справа 1272 0 справа 1273 0 справа 1274 0 справа 1275 0 справа 1276 0 справа 1277 0 справа 1278 0 R 1279 0 R 1280 0 R 1281 0 R 1282 0 R 1283 0 R 1284 0 R 1285 0 R 1286 0 R 1287 0 R 1288 0 R 1289 0 R 1290 0 R 1291 0 R 1292 0 R 1293 0 R 1294 0 1295 р. 1296 0 р. 1297 0 р. 1298 0 р. 1299 0 р. 1300 0 р. 1301 0 р. 1302 0 р. 1303 0 р. 1304 0 р. 1305 0 прав. 0 R 1312 0 R 1313 0 R 1314 0 R 1315 0 R 1316 0 R 1317 0 R 1318 0 R 1319 0 R 1320 0 R 1321 0 R 1322 0 R 1323 0 R 1324 0 R 1325 0 R 1326 0 R 1327 0 R 1328 0 R 1329 0 R 1330 0 R 1331 0 R 1332 0 R 1333 0 R 1334 0 R 1335 0 R 1336 0 R 1337 0 R 1338 0 R 1339 0 R 1340 0 R 1341 0 R 1342 0 R 1343 0 R 1344 0 R 1345 0 R 1346 0 R 1347 0 R 1348 0 R 1349 0 R 1350 0 R 1351 0 R 1352 0 R 1353 0 R 1354 0 R 1355 0 R 1356 0 R 1357 0 R 1358 0 R 1359 0 R 1360 0 R 1361 0 R 1362 0 R 1363 0 R 1364 0 R 1365 0 R 1366 0 R 1367 0 R 1368 0 R 1369 0 R 1370 0 R 1371 0 R 1372 0 R 1373 0 R 1374 0 R 1375 0 R 1376 0 R 1377 0 R 1378 0 справа 1379 0 справа 1380 0 справа 1381 0 справа 1382 0 справа 1383 0 справа 1384 0 справа 1385 0 справа 1386 0 справа 1387 0 справа 1388 0 справа 1 389 0 R 1390 0 R 1391 0 R 1392 0 R 1393 0 R 1394 0 R 1395 0 R 1396 0 R 1397 0 R 1398 0 R 1399 0 R 1400 0 R 1401 0 R 1402 0 R 1403 0 R 1404 0 R 1405 0 1406 0 R 1407 0 R 1408 0 R 1409 0 R 1410 0 R 1411 0 R 1412 0 R 1413 0 R 1414 0 R 1415 0 R 1416 0 R 1417 0 R 1418 0 R 1419 0 R 1420 0 R 1421 0 R 1422 0 R 1423 0 R 1424 0 R 1425 0 R 1426 0 R 1427 0 R 1428 0 R 1429 0 R 1430 0 R 1431 0 R 1432 0 R 1433 0 R 1434 0 R 1435 0 R 1436 0 R 1437 0 R 1438 0 R 1439 0 R 1440 0 R 1441 0 R 1442 0 R 1443 0 R 1444 0 R 1445 0 R 1446 0 R 1447 0 R 1448 0 R 1449 0 R 1450 0 R 1451 0 R 1452 0 R 1453 0 R 1454 0 R 1455 0 R 1456 0 R 1457 0 R 1458 0 R 1459 0 R 1460 0 R 1461 0 R 1462 0 R 1463 0 R 1464 0 R 1465 0 R 1466 0 R 1467 0 R 1468 0 R 1469 0 R 1470 0 R 1471 0 R]
эндобдж
230 0 объект
[1472 0 R 1473 0 R 1474 0 R 1475 0 R 1476 0 R 1477 0 R 1478 0 R 1479 0 R 1480 0 R 1481 0 R 1482 0 R 1483 0 R 1484 0 R 1485 0 R 1486 0 R 1487 0 R 1488 0 R 1489 0 R 1490 0 R 1491 0 R 1492 0 R 1493 0 R 1494 0 R 1495 0 R 1496 0 R 1497 0 R 1498 0 R 1499 0 R 1500 0 R 1501 0 R 1502 0 R 1503 0 R 1504 0 R 1505 0 R 1506 0 R 1507 0 R 1508 0 R 1509 0 R 1510 0 R 1511 0 R 1512 0 R 1513 0 R 1514 0 R 1515 0 R 1516 0 R 1517 0 R 1518 0 R 1519 0 R 1520 0 R 1521 0 R 1522 0 R 1523 0 R 1524 0 R 1525 0 R 1526 0 R 1527 0 R 1528 0 R 1529 0 R 1530 0 R 1531 0 R 1532 0 R 1533 0 R 1534 0 R 1535 0 R 1536 0 R 1537 0 R 1538 0 R 1539 0 R 1540 0 R 1541 0 R 1542 0 R 1543 0 R 1544 0 R 1545 0 R 1546 0 R 1547 0 R 1548 0 R 1549 0 R 1550 0 R 1551 0 R 1552 0 R 1553 0 R 1554 0 R 1555 0 R 1556 0 R 1557 0 R 1558 0 R 1559 0 R 1560 0 R 1561 0 R 1562 0 R 1563 0 R 1564 0 R 1565 0 R 1566 0 R 1567 0 R 1568 0 R 1569 0 R 1570 0 R 1571 0 1572 0 R 1573 0 R 1574 0 R 1575 0 R 1576 0 R 1577 0 R 1578 0 R 1579 0 R 1580 0 R 1581 0 R 1582 0 R 1583 0 R 1584 0 R 1585 0 R 1586 0 R 1587 0 R 1588 0 R 1589 0 R 1590 0 R 1591 0 R 1592 0 R 1593 0 R 1594 0 R 1595 0 R 1596 0 R 1597 0 R 1598 0 R 1599 0 R 1600 0 R 1601 0 R 1602 0 R 1603 0 R 1604 0 R 1605 0 R 1606 0 R 1607 0 R 1608 0 R 1609 0 R 1610 0 R 1611 0 R 1612 0 R 1613 0 R 1614 0 R 1615 0 R 1616 0 R 1617 0 R 1618 0 R 1619 0 R 1620 0 R 1621 0 R 1622 0 R 1623 0 R 1624 0 R 1625 0 R 1626 0 R 1627 0 R 1628 0 R 1629 0 R 1630 0 R 1631 0 R 1632 0 R 1633 0 R 1634 0 R 1635 0 R 1636 0 R 1637 0 R 1638 0 R 1639 0 R 1640 0 R 1641 0 R 1642 0 R 1643 0 R 1644 0 R 1645 0 R 1646 0 R]
эндобдж
231 0 объект
[1647 0 R 1648 0 R 1649 0 R 1650 0 R 1651 0 R 1652 0 R 1653 0 R 1654 0 R 1655 0 R 1656 0 R 1657 0 R 1658 0 R 1659 0 R 1660 0 R 1661 0 R 1662 0 R 1663 0 R 1664 0 R 1665 0 R 1666 0 R 1667 0 R 1668 0 R 1669 0 R 1670 0 R 1671 0 R 1672 0 R 1673 0 R 1674 0 R 1675 0 R 1676 0 R 1677 0 R 1678 0 R 1679 0 R 1680 0 R 1681 0 R 1682 0 R]
эндобдж
232 0 объект
[1683 0 R 1684 0 R 1685 0 R 1686 0 R 1687 0 R 1688 0 R 1689 0 R 1690 0 R 1691 0 R 1692 0 R 1693 0 R 1694 0 R 1695 0 R 1696 0 R 1697 0 R 1698 0 R 1699 0 R 1700 0 R 1701 0 R 1702 0 R 1703 0 R 1704 0 R 1705 0 R 1706 0 R 1707 0 R 521 0 R]
эндобдж
233 0 объект
[1708 0 R 1709 0 R 1710 0 R 1711 0 R 1712 0 R 1713 0 R 1714 0 R 545 0 R]
эндобдж
1708 0 объект
>
эндобдж
1709 0 объект
>
эндобдж
1710 0 объект
>
эндобдж
1711 0 объект
>
эндобдж
1712 0 объект
>
эндобдж
1713 0 объект
>
эндобдж
1714 0 объект
>
эндобдж
545 0 объект
>
эндобдж
40 0 объект
>
эндобдж
37 0 объект
> / MediaBox [0 0 595.0ef $ / WJKx

Купить ARBIDOL MAXIMUM Капсулы 200 мг N10 Умифеновир противовирусное средство для профилактики и лечения гриппа за 21,00 $ в магазине rusmedicines.com

Подробнее

ARBIDOL® MAXIMUM — усиленная * форма препарата для этиотропное лечение гриппа и ОРВИ, а также их профилактика у взрослых и детей старше 12 лет.

Молекула преимущества

• Действие препарата направлено на возбудителя гриппа и ОРВИ — вирусы;
• прямое противовирусное действие признано и изучено на международном уровне: умифеновир включен в классификатор Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в группу препаратов прямого противовирусного действия 1 — по механизму действия относится к ингибиторам слияния (слияния)
• включены в Клинических рекомендациях Министерства здравоохранения по лечению гриппа у взрослых с высоким уровнем достоверности и достоверности доказательств 5;
• ранняя готовность к действию — достижение максимальных концентраций в крови через 1.Через 5 часов с момента приема препарата 2;
• противовирусный эффект не зависит от иммунологического статуса организма, реактивности иммунной системы, скорости выработки интерферонов, а также от количества повторных курсов применения препарата;
• Терапевтическая активность при вирусных инфекциях проявляется в уменьшении длительности и тяжести течения болезни и ее основных симптомов, а также в уменьшении частоты осложнений и обострений хронических бактериальных заболеваний
• снижает общую продолжительность гриппа на 2.8 дней, интоксикация — на 2,2 дня, простудные симптомы — на 2,5 дня, продолжительность лихорадки — на 1,3 дня 3;
• снижает риск развития осложнений гриппа и ОРВИ: пневмонии — на 98%, бронхита — на 90%, синусита — на 78% 3;
• многолетний опыт применения и всесторонние знания, продемонстрированные как в крупномасштабных многоцентровых рандомизированных клинических испытаниях 4.7, так и в многочисленных программах наблюдения 8-11
• , рекомендованных Научно-исследовательским институтом гриппа для лечения гриппа у взрослых 5;
• профилактическое использование в сезон эпидемий снижает заболеваемость острыми респираторными инфекциями до 3.6 раз по 6;
• профилактическое введение при контакте с больным гриппом или другими ОРВИ снижает риск заражения после контакта с пациентом до 7 раз 6.

Преимущества формы выпуска АРБИДОЛ® МАКСИМУМ

• двойной удар * вирусам простуды и гриппа в каждой капсуле;
• Доза 200 мг, рекомендованная для одноразового применения взрослыми и детьми старше 12 лет;
• простота использования — возможность принимать всего одну капсулу вместо двух *;
• оптимизация лечебного процесса — предотвращение необходимости повторных покупок препарата во время лечения — разовая покупка одной упаковки вместо двух **;

Показания к применению АРБИДОЛА МАКСИМУМ

профилактика и лечение вирусных инфекций у взрослых и детей старше 12 лет:

• грипп типа А и В, другие ОРВИ
• комплексная терапия острых кишечных инфекций ротавирусной этиологии у детей старше 12 лет;
• комплексная терапия рецидивирующей герпетической инфекции;
• профилактика послеоперационных инфекционных осложнений.

Объем рынка и доля арбидола в 2021 г.

Форт-Коллинз, Колорадо: В отчете под названием « Размер рынка арбидола по типам, применению, сегментации и росту — глобальный анализ и прогноз до 2021-2027 гг. » впервые были представлены основы арбидола: определения, классификации, применения, и Обзор рынка; Характеристики продукта; Способ производства; Структура затрат, сырье и т. Д. В отчете учитывается влияние новой пандемии COVID-19 на рынок арбидола, а также дается оценка определения рынка, а также определение основных ключевых производителей, контрастирующих с конкурентной средой. с точки зрения цены, выручки, мощности, импорта, экспорта, размера рынка арбидола, потребления, валовой прибыли, валовой прибыли, продаж и доли рынка.Количественный анализ индустрии арбидола с 2015 по 2020 год по регионам, типу, применению и оценка потребления по регионам.

(Эксклюзивное предложение: фиксированная скидка 30% на этот отчет)

Получить | Загрузить образец копии @ https://reportsglobe.com/download-sample/?rid=102705

Следующие компании являются основными участниками исследования рынка Арбидола:

• ОАО «Фармстандарт»
• Shenyang Coupling Biomedical Technology Co.
• Ltd.
• Shandong Chuangxin Pharmaceutical Research and Development Co.
• ООО
• Yichang Tianren Pharmaceutical Co.
• Ltd

Сегментация рынка арбидола:

На основе типа

На основании заявки

• Больница
• Клиники
• Аптека

По региону:

• Северная Америка (США, Канада и Мексика)
• Европа (Германия, Франция, Великобритания, Россия и Италия)
• Азиатско-Тихоокеанский регион (Китай, Япония, Корея, Индия и Юго-Восточная Азия)
• Южная Америка (Бразилия, Аргентина, Колумбия и др.)
• Ближний Восток и Африка (Саудовская Аравия, Объединенные Арабские Эмираты, Египет, Нигерия и Южная Африка)

Запросить скидку на отчет @ https://reportsglobe.com/ask-for-discount/?rid=102705

Отчет включает информацию о конкурентах:

? Основные тенденции роста и прогнозы по регионам и странам
? Основные выигрышные стратегии, которых придерживаются конкуренты
? Кто основные конкуренты в этой отрасли?
? Каков потенциал этой отрасли в ожидаемой перспективе?
? Какие факторы определяют спрос на арбидол?
? Какие возможности будут способствовать значительному распространению роста рынка?
? Какие региональные и национальные правила будут препятствовать или стимулировать спрос на арбидол?
? Какое влияние covid-19 оказал на рост рынка?
? Вызвал ли перерыв в цепочке поставок изменения во всей цепочке создания стоимости?

Объем отчета:

Отчет об исследовании рынка Arbidol Market Research Report — всеобъемлющее издание, целью которого является определение финансовых перспектив рынка.По той же причине он предлагает подробное понимание конкурентной среды. В нем рассматриваются некоторые из ключевых игроков, их стили руководства, их статус в области исследований и разработок, а также их стратегии расширения.

Отчет также включает портфели продуктов и список продуктов в разработке. Он предоставляет подробное объяснение передовых технологий и инвестиций, которые были сделаны для обновления существующих технологий.

Просмотрите снимок рынка перед покупкой @ https: // reportsglobe.ru / product / global-arbidol-market insight-and-прогноз /

Некоторые моменты из TOC

Глава 1 Обзор рынка

Глава 2 Профиль компании

Глава 3 Конкуренция игроков на рынке

Глава 4 Сегмент размера рынка по типу

Глава 5 Сегмент размера рынка по приложениям

Глава 6 Северная Америка по странам, типам и приложениям

Раздел 7 Европа по странам, типам и областям применения

Глава 8 Азиатско-Тихоокеанский регион по регионам, типам и приложениям

Раздел 9 Южная Америка по странам, типам и приложениям

Chapter 10 Ближний Восток и Африка по странам, типам и приложениям

Глава 11 Результаты исследований и выводы

Глава 12 Приложение

Запросите настройку отчета @ https: // reportsglobe.ru / need-customization /? rid = 102705

Настройка отчета:

Свяжитесь с нами, если вам нужна дополнительная информация об отчете. Если у вас есть какие-либо особые требования и вы хотите настроить их, сообщите нам об этом. Затем мы предложим отчет по вашему желанию.

Чем Reports Globe отличается от других поставщиков маркетинговых исследований:

Создание Reports Globe было поддержано предоставлением клиентам целостного представления о рыночных условиях и будущих возможностях / возможностях получения максимальной прибыли от своего бизнеса и помощи в принятии решений.Наша команда внутренних аналитиков и консультантов неустанно работает, чтобы понять ваши потребности и предложить наилучшие возможные решения для выполнения ваших исследовательских требований.

Наша команда в Reports Globe тщательно проверяет данные, что позволяет нам публиковать отчеты издателей с минимальными отклонениями или без них. Отчеты Globe ежегодно собирает, разделяет и публикует более 500 отчетов, касающихся продуктов и услуг в различных областях.

Свяжитесь с нами:

г.Марк Уильямс

Менеджер по работе с клиентами

США: + 1-970-672-0390

Электронная почта: [электронная почта защищена]

Веб-сайт : Reportsglobe.com

Результаты Саркари, исследование рынка Thrive

Сегментация и объем рынка арбидола гидрохлорида (COVID-19) — Сеть Bisouv

Contrive Datum Insights Pvt. Ltd. недавно обнародовала новые статистические данные под названием «Рынок арбидола гидрохлорида (COVID-19) в 2020 году по производителям, регионам, типам и областям применения, прогноз до 2027 года».

Включает исследования о текущих тенденциях в различных секторах на основе их объема. Аналитик этого отчета сосредотачивается на статических и динамических столпах отраслей для базового понимания стратегий. В дополнение к этому, он определяет драйверы и возможности для развития бизнеса. Кроме того, он фокусируется на ограничениях для анализа проблем, связанных с существующими бизнес-стратегиями. Он фокусируется на различных аспектах, таких как области приложений, платформы и ведущих игроков, работающих по всему миру.

Лучшие ключевые игроки:

АО Фармстандарт
Simcere Pharmaceutical
Jiangsu Wuzhong Pharmaceutical
CSPC Ouyi Pharmaceutical
Jiangsu Lianshui Pharmaceutical

Кроме того, ведущие производители находятся в разных регионах, таких как Япония, Китай, Азия, Европа и Индия. В исследовании объясняются факты и цифры о производстве, цене и доходах рынка арбидола гидрохлорида (COVID-19). Чтобы дать четкое представление о мировом рынке гидрохлорида арбидола (COVID-19), было рассмотрено несколько вопросов в зависимости от отраслей.

Бесплатный образец отчета + все связанные графики и диаграммы (включая анализ воздействия COVID19) @: https://www.contastedatuminsights.com/request-sample/101025

Для аудита рынка изучаются различные методы оценки рынка. Отчет выделен на основе исторических данных, текущей статистики и прогнозов на будущее. Наряду с этим, финансовый обзор и последние события эффективно объясняются, чтобы дать лучшее представление о росте бизнеса.

Он обобщает подробную информацию о сегментах рынка на основе различных терминов, таких как стратегия, объем и производственная база. Продавцы, а также покупатели являются важными ключевыми игроками на этом рынке, и, следовательно, в настоящем отчете они подробно рассматриваются. В дополнение к этому, в исследовании объясняется влияние ключевых факторов на внутренний и мировой рынок.

Доступен 20% скидка на различные типы лицензий при немедленной покупке @: https: // www.contvedatuminsights.com/request-discount/101025

Глобальный сегмент рынка арбидола гидрохлорида (COVID-19):

По типу

Таблетки гидрохлорида арбидола
Капсулы гидрохлорида арбидола
Гранулы гидрохлорида арбидола

По заявке

Вирус против гриппа
COVID-19

Баллы, указанные в отчете

• В отчете обсуждаются основные участники рынка, участвующие в нем, такие как участники рынка, поставщики сырья, поставщики оборудования, конечные пользователи, трейдеры, дистрибьюторы и т. Д.
• Приведен полный профиль компаний. А мощность, производство, цена, выручка, стоимость, валовая прибыль, валовая прибыль, объем продаж, выручка от продаж, потребление, темпы роста, импорт, экспорт, поставки, будущие стратегии и технологические разработки, которые они делают, также включены в отчет. В этом отчете проанализированы данные и прогноз за 12 лет.
• Подробно обсуждаются факторы роста рынка и подробно объясняются различные конечные пользователи рынка.
• Данные и информация по участникам рынка, по регионам, по типам, по приложениям и т. Д., А также пользовательские исследования могут быть добавлены в соответствии с конкретными требованиями.
• Отчет содержит SWOT-анализ рынка. Наконец, отчет содержит заключительную часть, в которую включены мнения отраслевых экспертов.

Таблица содержания (TOC):

Глава 1 Введение и обзор

Глава 2 Структура затрат отрасли и экономическое влияние

Глава 3 Растущие тенденции и новые технологии с основными ключевыми игроками

Глава 4 Глобальный анализ рынка гидрохлорида арбидола (COVID-19), тенденции, фактор роста

Глава 5 Применение на рынке гидрохлорида арбидола (COVID-19) и бизнес с потенциальным анализом

Глава 6 Глобальный сегмент рынка гидрохлорида арбидола (COVID-19), тип, применение

Глава 7 Глобальный анализ рынка гидрохлорида арбидола (COVID-19) (по применению, типу, конечному пользователю)

Глава 8 Анализ рынка гидрохлорида арбидола (COVID-19), основными поставщиками

Глава 9 Тенденции развития анализа

Заключение по Главе 10

Получите отчет об исследовании в течение 48 часов: https: // www.contvedatuminsights.com/buy/101025

Примечание: Это содержание не содержит всей информации отчета, пожалуйста, заполните форму (по ссылке) и получите всю интересующую информацию всего одним щелчком мыши в формате PDF с последним обновлением с диаграммой и таблицей содержания

Если есть какие-либо особые требования к этому отчету, сообщите нам, и мы можем предоставить индивидуальный отчет.

О нас:

Contrive Datum Insights Pvt. Ltd. (CDI) является глобальным партнером по доставке информации о рынке и консультационных услуг для должностных лиц в различных секторах, таких как инвестиции, информационные технологии, телекоммуникации, потребительские технологии и производственные рынки.CDI помогает инвестиционным сообществам, руководителям предприятий и ИТ-специалистам принимать точные статистические решения о закупках технологий и продвигать тактику сильного роста для поддержания конкурентоспособности на рынке. Contrive Datum Insights, объединяющая в себе команду из более чем 100 аналитиков и совокупный опыт работы на рынке более 200 лет, гарантирует предоставление отраслевых знаний в сочетании с глобальным и национальным опытом.

Свяжитесь с нами:

Анна Бойд

Contrive Datum Insights Pvt.ООО

Канада: +1